[发明专利]一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法和应用，通过构建可用于活体检测心肌细胞自噬以及自噬流的转基因斑马鱼模型，并建立相关药物处理后对心肌细胞自噬水平以及自噬流变化的检测方法。该方法不仅可以快速检测各类药物对调节心肌细胞自噬的作用，还可用于心肌细胞自噬相关药物的筛选、自噬在心脏各类疾病中的作用以及不同分子通路在心肌细胞自噬调节中的机制研究等。

技术领域

本发明属于医药领域，尤其是涉及一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法和应用。

背景技术

自噬是调节细胞稳态的重要通路，目前多项研究工作表明心肌细胞的自噬在心脏发育、心脏疾病的发生和治疗中有重要作用。相关研究表明调节心肌细胞自噬从而减少心肌细胞凋亡的是缓解各类心脏疾病的重要途径之一。

自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡(自噬小体)，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，以实现细胞稳态和细胞器更新。细胞可以通过自噬途径降解自身的非必需成分来提供能量和营养，也可以降解一些毒性成分以阻止细胞损伤和凋亡。目前的自噬检测主要是通过观察膜状结构的自噬体以及检测自噬标志物LC3，且由于LC3检测的便利性更常见的是检测自噬标志物LC3来指针自噬水平。通过荧光蛋白融合LC3可通过荧光信号聚集点来统计自噬小体的数量和密度从而分析自噬发生的水平。

以往检测动物模型中心肌细胞的自噬水平是处死动物获取心脏组织并通过切片后生化或对特定分子的染色后来检测，这样往往需要较多实验环节和周期，成本较大，同样也不能检测自噬调节的动态过程，且无法快速以及较大规模的检测各类药物或不同分子途径在调节心肌细胞自噬中的作用。

中国专利CN 112322661 A公开了一种精确定量检测自噬流的方法，步骤如下：(1)构建EGFP/LC3HIBIT共表达载体，EGFP和LC3HIBIT分别用于独立的启动子，互不影响；(2)通过瞬转或筛选单克隆的方法，获得EGFP和LC3-HIBIT蛋白的共同表达的细胞；(3)筛选单克隆稳转细胞后，可在此细胞的基础上进行与自噬相关的各种遗传操作，及筛选自噬相关药物等；(4)在多功能酶标仪上设置程序分别测定发光和荧光读值，以EGFP为该实验中的内参，校准因细胞差异导致的HIBIT读值，从而准确反映细胞的自噬程度。但是该专利技术方案是非活体检测，应用局限性较大。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可快速大规模检测各类药物或不同分子途径在调节心肌细胞自噬中的作用的指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

提供一种指示心肌细胞自噬或自噬流的转基因斑马鱼模型的构建方法，包括以下步骤：

构建特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼，该特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼中能够共表达EGFP-LC3；

构建特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼，该特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼中能够共表达mRFP-EGFP-LC3。

进一步地，利用tol2转座子系统构建特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼，或构建特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼。

进一步地，构建荧光蛋白EGFP和自噬相关蛋白LC3共表达的载体，然后基于该载体获得特异标记心肌细胞自噬小体的转基因斑马鱼。

进一步地，构建荧光蛋白EGFP、荧光蛋白mRFP和自噬相关蛋白LC3共表达的载体，然后基于该载体获得特异标记心肌细胞自噬流的转基因斑马鱼。

进一步地，使用斑马鱼myl7启动子在斑马鱼心肌细胞中表达荧光蛋白EGFP和自噬相关蛋白LC3；或，