[发明专利]一种高效液相色谱串联质谱检测全血中免疫抑制剂的检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供一种高效液相色谱串联质谱检测全血中免疫抑制剂的检测试剂盒及其检测方法，通过在内标液中添加抗氧化剂维生素E，并与含有七水合硫酸锌、纯化水和甲醇的内标稀释液混合，用于样本前处理，既可发挥内标的作用，还可同步实现红细胞处理、蛋白沉淀和目标物质提取，并使免疫抑制剂在溶液基质中更加稳定，从而提升检测准确性和灵敏度；同时本发明还采用同位素标记的西罗莫司作为依维莫司的内标，用于代替同位素标记的依维莫司，克服了依维莫司对同位素标记依维莫司的干扰，满足检测要求，可同时检测四种免疫抑制剂，降低内标成本，检测成本更低，检测结果更加准确和稳定。

技术领域

本发明属于生物化学分析技术领域，具体而言，涉及一种高效液相色谱串联质谱检测全血中免疫抑制剂的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

免疫抑制剂是一类可抑制机体异常反应的药物，能够抑制与免疫反应有关细胞(T细胞和B细胞等巨噬细胞)的增殖和功能，降低免疫应答。在临床上主要用于防止器官移植时的排斥反应以及自身免疫性疾病的治疗，如风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤真菌病、炎性肠病和自身免疫性溶血贫血等。随着人类对免疫应答规律认识的不断深入，一些高效低毒的新型免疫抑制剂如环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司和依维莫司等，得到了开发和应用。免疫抑制剂的药代动力学存在明显的个体内及个体之间的差异，且治疗浓度与中毒浓度接近，血药浓度稍高出现毒副作用，稍低则出现排斥反应，治疗窗很窄。由于药物的疗效和毒副作用均与用药剂量密切相关，可通过体内药物浓度的监测，合理地指导临床调整用药剂量，确保药物浓度处于安全有效的治疗范围。

免疫抑制剂可以单独使用，也可联合使用以增强药物疗效或减轻药物毒副作用。从作用机理上来看，环孢霉素A和他克莫司属于钙神经蛋白抑制剂，主要通过抑制T细胞活化而发挥免疫抑制作用。环孢霉素A是由11个氨基酸构成的环肽，具有较强的亲脂性，血液中约50％的环孢霉素A被红细胞摄取，30％结合在血浆脂蛋白和其他蛋白上，可使用全血或血浆对其进行血药浓度的监测。他克莫司是从链霉菌的代谢产物中分离得到大环内酯类化合物，体外实验证实其免疫活性是环孢霉素A的50-100倍。他克莫司主要经胃肠道吸收，在血中绝大部分分布于红细胞，临床上使用全血血药浓度的监测来调整其最佳用药剂量。西罗莫司及其衍生物依维莫司是三烯大环内酯类化合物，为哺乳动物西罗莫司靶蛋白抑制剂，用药后广泛分布于各组织，在血液中主要与红细胞结合，因此临床上也采用全血样本进行药物浓度监测。

目前国内外有关全血中免疫抑制剂的测定方法报道很多，常见的方法有：免疫分析、液相色谱法，在众多的方法中，液相串联质谱法为测定免疫抑制剂的首选方法。但是以往方法普遍存在操作过程复杂、干扰因素多、特异性差、分析时间长、检测通量低的问题，这主要都是因为样品前处理过程繁琐、稳定性差所造成的。

现有的免疫抑制剂样品前处理方法主要有蛋白沉淀、液液萃取等，如CN109187839A，采用硫酸锌和甲醇溶液作为蛋白沉淀剂对全血样本进行前处理，从而进行样本中他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢霉素A四种免疫抑制剂的检测，但由于其样本前处理过程存在稳定性差的问题，导致检测结果容易受干扰，误差大，检测灵敏度不高。

因此迫切需要一种操作简单、处理效率高、检测通量高、检测准确度和灵敏度高、成本低、人工工作量小等优点的免疫抑制剂样品前处理方法，使其可以克服现有方法的以上不足和缺陷。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种改进的高效液相色谱串联质谱同时检测全血中4种免疫抑制剂的检测试剂盒及其检测方法，通过在内标液中添加抗氧化剂维生素E，并与含有七水合硫酸锌、纯化水和甲醇的内标稀释液混合，用于样本前处理，一步操作实现红细胞处理、蛋白沉淀和内标添加，并使免疫抑制剂在溶液基质中更加稳定，从而提升检测准确性和灵敏度；同时本发明还采用同位素标记的西罗莫司作为依维莫司的内标，用于代替同位素标记的依维莫司，克服了依维莫司对同位素标记依维莫司的干扰，满足检测要求，降低内标成本，检测成本更低，检测结果更加准确和稳定。