[发明专利]一种联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法

说明书

本发明公开了一种联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法，属于生物技术领域。所述分析方法包括：获取原代鱼上皮细胞；原代鱼上皮细胞是经传代获取的第一代细胞，再用探针组合对第一代细胞进行探针标记和共孵育；基于高内涵筛选系统，选择不同探针对应的荧光通道，对孵育后的细胞荧光表达量进行定量；基于标准化欧式距离针对Ca⁺⁺、ROS和MMP 3个维度构建鱼上皮细胞早期损伤的分析模型，并对早期损伤影响进行综合判定。本发明构建一整套可实现鱼类感染细菌、病毒以及寄生虫后诱导早期损伤程度的综合判定程序；为研究药物对感染细菌、病毒以及寄生虫的鱼类的保护作用及其机制提供方法，为候选药物筛选以及耐药性研究等提供支撑。

技术领域

本发明涉及生物领域，特别是涉及一种联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法。

背景技术

在淡水和海水养殖过程中，由于致病性微生物、寄生虫或非寄生等因素可导致鱼类诸多疾病，而鱼类皮肤是一道重要的免疫保护屏障，可有效阻止致病菌、真菌、寄生虫以及单胞藻类的感染。受损则会导致出血病、病毒性出血性败血症、上皮囊肿病和痘疥病等疾病发生，严重可导致鱼群大量死亡，对渔业经济及可持续发展造成巨大损失。其中嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血性弧菌、粪球菌以及大肠杆菌等为常见细菌性病害。据报道，嗜水气单胞菌感染会引起氧化应激，增加细胞内活性氧(ROS)以及自由基生成，并激活抗氧化防御机制，从而导致机体损伤；还可刺激非特异性免疫反应，导致线粒体功能受损等，并可能在感染后期诱发细胞凋亡。另外，BANERJE等提出嗜水气单胞菌感染方式为被巨噬细胞主动内吞，细菌依赖宿主蛋白生存，继而改变胞质钙稳态，启动钙蛋白酶的活化，后期促发caspase-3介导的巨噬细胞凋亡。目前嗜水气单胞菌侵袭研究主要基于体外敏感细胞系，包括利用胖头鱥肌肉细胞系(FHM)、虹鳟性腺细胞系(RTG-2)、草鱼肾细胞系(CIK)等细胞系，而利用鱼类上皮细胞研究很少；同时采用传统体外细胞毒性评价表征晚期毒性，对亚细胞及早期损伤的多种重要信号同步捕获及综合评价严重不足，从而对相关机制阐述等存在局限性。

发明内容

本发明的目的是提供一种联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法，以解决上述现有技术存在的问题，可实现鱼类感染细菌、病毒以及寄生虫后早期损伤程度的综合判定；辅助药物对感染细菌、病毒以及寄生虫的鱼类的保护作用及其机制研究，为候选药物筛选以及耐药性研究等提供依据和支撑。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法，包括以下步骤：

获取原代鱼上皮细胞；

所述原代鱼上皮细胞是经传代获取的第一代细胞，再用探针组合对所述第一代细胞进行探针标记和共孵育；

基于高内涵筛选系统，选择不同探针对应的荧光通道，对孵育后的细胞荧光表达量进行定量；

基于标准化欧式距离来构建针对Ca⁺⁺、ROS和MMP等3个维度对鱼上皮细胞早期损伤综合判定的方法，模型为：

模型中，Ca⁺⁺_实验和Ca⁺⁺_{空白或阴性}、MMP_实验和MMP_{空白或阴性}、ROS_实验和ROS_{空白或阴性}分别表示相应组别的钙离子、线粒体膜电位和氧化应激的平均荧光表达量；S_Ca++、S_MMP和S_ROS分别表示钙离子、线粒体膜电位和氧化应激相应的标准差。

优选的是，当所述第一代细胞生长汇合至80％～90％时，用活性氧(ROS)、活性钙离子(Ca⁺⁺)和线粒体膜电位(MMP)探针组合进行同步标记。