[发明专利]一种联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法

权利要求书

1.一种联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取原代鱼上皮细胞；

所述原代鱼上皮细胞是经传代获取的第一代细胞，再用探针组合对所述第一代细胞进行探针标记和共孵育；

基于高内涵筛选系统，选择不同探针对应的荧光通道，对孵育后的细胞荧光表达量进行定量；

基于标准化欧式距离构建针对Ca⁺⁺、ROS和MMP 3个维度对鱼上皮细胞早期损伤综合判定的模型，所述模型为：

模型中，Ca⁺⁺_实验和Ca⁺⁺_{空白或阴性}、MMP_实验和MMP_{空白或阴性}、ROS_实验和ROS_{空白或阴性}分别表示相应组别的钙离子、线粒体膜电位和氧化应激的平均荧光表达量；S_Ca++、S_MMP和S_ROS分别表示钙离子、线粒体膜电位和氧化应激相应的标准差。

2.根据权利要求1所述的联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法，其特征在于，当所述第一代细胞生长汇合至80%~90%时，用针对活性氧ROS、活性钙离子Ca⁺⁺和线粒体膜电位MMP的探针组合进行同步标记。

3.根据权利要求2所述的联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法，其特征在于，所述探针组合包括CellROX、Calcium Orange和Mito组合或具有同等功能的探针组合。

4.根据权利要求3所述的联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法，其特征在于，所述CellROX、Calcium Orange和Mito工作液最佳浓度分别为5μM、100nM和100nM。

5.根据权利要求1所述的联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法，其特征在于，所述探针标记还包括Hoechst，用所述Hoechst标记细胞核，以定位细胞。

6.根据权利要求5所述的联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法，其特征在于，所述Hoechst最佳工作浓度为1mg/mL。

7.根据权利要求1所述的联合筛查鱼上皮细胞早期损伤的高通量分析方法，其特征在于，孵育条件为：避光室温或37℃下孵育20~40min。

8.根据权利要求1-7任一项所述的分析方法在研究药物对感染细菌、病毒以及寄生虫鱼类的保护作用及其机制中的应用。

9.根据权利要求1-7任一项所述的分析方法在防治鱼类感染细菌、病毒以及寄生虫的候选药物筛选及耐药性研究中的应用。