[发明专利]基于lux报告系统的猪链球菌发光菌及其构建方法

说明书

本发明公开了基于lux报告系统的猪链球菌发光菌及其构建方法。本发明提供了一种猪链球菌发光菌，是将荧光素酶报告系统敲入片段定点插入到猪链球菌的基因组中SSU05_0518基因和SSU05_0519基因之间后得到的；所述荧光素酶报告系统敲入片段自5’端到3’端依次包含用于表达荧光素酶报告系统的基因簇luxAB和luxCDE的两个表达盒，以及用于表达抗性标记基因的表达盒。本发明通过设计7种猪链球菌发光菌的构建策略，优化筛选不同的启动子，最终建立了一种基于lux报告系统的猪链球菌发光菌的构建方法，可以在小鼠体内实时观察到细菌，在猪链球菌的感染途径及致病机制研究上具有一定的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于lux报告系统的猪链球菌发光菌及其构建方法。

背景技术

猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原体，每年都会给猪养殖业造成巨大的损失，近年来，人感染猪链球菌的病例每年仍有报道，在东南亚地区，尤其是泰国和越南，猪链球菌感染已经成为越南成人脑膜炎的首要病因，在泰国成人脑膜炎病因中排名第二位，引起了人们越来越多的关注，关于猪链球菌的感染途径以及其相关的毒力因子是猪链球菌研究中的重点。虽然之前有报道基于绿色荧光蛋白来实现对猪链球菌的示踪观察，但是只能在体外实验中使用，无法在动物体内进行实时观察。

来源于发光细菌的lux报告系统的核心元件包括luxA、B、C、D、E五个基因，其中luxA、luxB分别编码荧光酶的α和β亚基,而luxC、luxD、luxE分别编码依赖NADPH的脂肪酸还原酶、酰基转移酶和ATP合成酶，三者共同构成脂肪酸还原酶复合体，产生长链脂肪醛作为发光反应的电子供体。因其具有即时性和高灵敏度，在分子生物学、临床微生物及生化检测中呈现出潜在的应用价值。肺炎链球菌、化脓链球菌以及金黄色葡萄球菌等致病菌均有基于该系统构建的发光菌的报道，在细菌的感染进程以及致病机制研究中发挥了重要的作用。

发明内容

为了有效解决上述技术问题，本发明旨在提供一种可以在动物体内进行实时观察的基于lux报告系统的猪链球菌发光菌及其构建方法。

第一方面，本发明要求保护一种猪链球菌发光菌。

本发明要求保护的猪链球菌发光菌是将荧光素酶报告系统敲入片段定点插入到猪链球菌的基因组中SSU05_0518基因和SSU05_0519基因之间后得到的。其中，所述SSU05_0518基因和SSU05_0519基因为NCBI的Refseq数据库里面的05ZYH33菌株的基因注释。其中，所述“将荧光素酶报告系统敲入片段定点插入到猪链球菌的基因组中SSU05_0518基因和SSU05_0519基因之间”可包括将所述荧光素酶报告系统敲入片段取代猪链球菌的基因组中SSU05_0518基因和SSU05_0519基因之间的部分序列。

所述荧光素酶报告系统敲入片段自5’端到3’端依次包含表达盒1、表达盒2和表达盒3；所述表达盒1用于表达荧光素酶报告系统的基因簇luxAB；所述表达盒2用于表达荧光素酶报告系统的基因簇luxCDE；所述表达盒3用于表达抗性标记基因。

进一步地，在所述表达盒2中，启动所述基因簇luxCDE转录的启动子可为CP25G启动子；所述CP25G启动子是以CP25启动子为基础，经改造后得到的带有AGGAGG序列的启动子。

更进一步地，所述CP25G启动子的核苷酸序列可如SEQ ID No.1的第3437-3573位所示。

进一步地，在所述表达盒1中，启动所述基因簇luxAB转录的启动子可为147AGGAGG启动子或1647AGGAGG启动子或1647启动子。

所述147AGGAGG启动子为以猪链球菌基因组中SSU05_0147基因启动子为基础，经改造后得到的带有AGGAGG序列的启动子。所述1647AGGAGG启动子为以猪链球菌基因组中SSU05_1647基因启动子为基础，经改造后得到的带有AGGAGG序列的启动子。所述1647启动子为猪链球菌基因组中SSU05_1647基因启动子。