[发明专利]一种适用于质谱鉴定的毛干蛋白质提取方法及其应用

说明书

本发明涉及适用于质谱检测的毛干蛋白提取方法，包括：向样本中加入增溶溶液，并进行超声处理，超声处理采用的超声处理装置包括换能器以及超声发生器，换能器第一端连接超声发生器，换能器远离第一端的相对端包括一个或多个超声发生槽，将样本与增溶溶液的混合物直接置入超声发生槽，以进行超声处理；样本蛋白质混合物中加入沉淀溶液，以沉淀蛋白质，加入增溶溶液复溶蛋白质沉淀；向混合物中加入酶，以酶切蛋白质，获得肽混合物。通过本发明的提取方法对样本进行高效的蛋白质提取，然后采用质谱仪进行高灵敏度蛋白质组学检测，获得质谱数据，可以进一步用于SNP位点检测和个体鉴定，可以有效克服采用毛干作为样品进行个体鉴定的问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于质谱检测的蛋白提取方法，具体涉及一种适用于质谱鉴定的毛干蛋白质提取方法及其在超高灵敏度蛋白质谱检测以及中的应用。

背景技术

DNA是生物的遗传信息载体，随着目前分子生物学技术的快速发展，通过DNA信息分析在多个领域中用于物种鉴定或个体鉴定。单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，是新一代的可用于鉴定的遗传标记。SNP可以作为个体身份识别的标志物，而用于SNP位点的检测方法通常依赖于DNA的提取。

毛发作为一种易于获取的无创、运输和储存方便的生物样本，已成为法医学、遗传学常用的检测材料之一，在侦破案件中发挥重要作用，为物种鉴定、个体鉴定、系统进化、刑侦法医等方面研究有着十分重要的意义。毛发易损伤脱落，常遗留于盗窃、抢劫等犯罪现场，在被害人或犯罪嫌疑人身上，犯罪工具上，衣物上等处常可获取到毛发样本，且毛发性质稳定、不易变质，性质稳定，因此常用于法医学鉴定等场合中。然而，对于脱落毛发的检验一直是DNA信息获取的难题，一方面由于毛发样本往往很难保证其包含毛囊部分，而毛干是毛发露出皮肤的部分，相对于毛囊，其DNA含量更少，主要成分为角蛋白，占毛干总重量的85％～90％，能够从毛干样本中获得的DNA含量很少，另一方面毛发中的DNA极易降解，因此，通过毛干DNA检测SNP位点，并进一步用于个体鉴定的可行性较低。

蛋白质序列是基因组DNA的外显子经过转录、翻译得到，因而部分DNA外显子中的单碱基突变会导致对应氨基酸的改变，这让从氨基酸位点突变反推SNP位点有可靠的理论依据。单个氨基酸多态性(Single amino acid polymorphism，SAP)通常是指单个氨基酸突变所造成的肽段的多态性，可遗传变异肽(genetically variant peptides,GVP)是指包括一个或多个氨基酸突变的特异性肽段，通常GVP包含了SAP的情形。得益于质谱技术的重大突破和蛋白质分离、富集方法的进步，基于质谱的蛋白质组学研究的灵敏性和准确性都得到了很大的提升，通过蛋白质来鉴定GVP变得可行，因此，在法医学研究中，可以通过毛干样本获取相应蛋白质组学数据，并进一步对该蛋白质组学数据进行处理和分析，以高效获得氨基酸突变位点，从而进行个体鉴定。

然而，现有技术中还未有关于如何高效提取毛干样本中的蛋白质，以用于高效质谱检测的报道。

现有的头发分析技术在进行鉴定时要经过多个步骤，而每进行一步都会损失一些蛋白质，所以需要大量的头干来提取分析所需的蛋白质。由于每个人的毛干的量各不相同，在特殊条件下，我们仅能获取有限的毛干，这时对其蛋白质进行提取也比较困难，如果提取方法、条件不合适，容易造成蛋白质大量损失，从而影响后续分析。

在场所能获取到的毛干量较少的情况下，毛干角蛋白分析的微量化和灵敏度是如何进行个体鉴定的难题。如何对毛干样本蛋白提取过程进行优化，寻求一种操作简便高效、稳定快速、杂质含量少、用于个体鉴定灵敏度高的方法，至今仍是一个技术难题，因此成为生物鉴定领域一项重要的研究课题。

发明内容