[发明专利]一种生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌、构建方法及应用

权利要求书

1.一种生物合成2-苯乙醇的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：包括，

敲除受体菌的短链脱氢酶编码基因或抑制所述短链脱氢酶编码基因的表达或抑制所述短链脱氢酶编码基因编码的蛋白质的活性，获得突变株PE1；

增加所述突变株PE1中酮酸脱羧酶编码基因编码蛋白质的表达量或增强所述酮酸脱羧酶编码基因编码蛋白质的活性，获得突变株PE2；

增加所述突变株PE2中酪氨酸转氨酶编码基因和醇脱氢酶编码基因编码蛋白质的表达量或增强转氨酶基因和醇脱氢酶编码基因编码蛋白质的活性，获得突变株PE3；

所述受体菌为谷氨酸棒杆菌ATCC 21420；

所述获得突变株PE1的具体方法为，以cg0641a和cg0641b为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 21420的基因组为模板，使用fast Pfu 高保真聚合酶扩增大小为750bp的上游同源臂；以cg0641c和cg0641d为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 21420的基因组为模板，使用fastPfu 高保真聚合酶扩增大小为793bp的下游同源臂；回收上下游同源臂后，以cg0641a和cg0641d为引物进行融合PCR得到大小为1543bp的融合产物；将融合产物和敲除载体pK18mobsacB分别用HindIII和XbaI酶切后并连接得到重组质粒pK18mobsacB-cg0641；将重组质粒pK18mobsacB-cg0641电击转化至谷氨酸棒杆菌 ATCC 21420，经过两步同源重组获得突变株PE1；所述引物cg0641a的序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物cg0641b的序列如SEQID NO.3所示；所述引物cg0641c的序列如SEQ ID NO.4所示；所述引物cg0641d的序列如SEQID NO.5所示；

所述获得突变株PE2的具体方法为，将酮酸脱羧酶编码基因经过密码子优化后合成如SEQ ID NO.6所示的片段，将所述片段和pXMJ19分别用HindIII和PstI酶切后并连接得到重组质粒pXMJ19-aro10，将所述重组质粒pXMJ19-aro10电击转化至突变株 PE1中，获得突变株PE2；

所述获得突变株PE3的具体方法为，将酪氨酸转氨酶编码基因经过密码子优化后合成如SEQ ID NO.7所示的片段，将所述片段和pECXK99E分别用EcoRI和KpnI酶切后并连接得到重组质粒pECXK99E-tyrB；

将醇脱氢酶编码基因经过密码子优化后合成如SEQ ID NO.8所示的片段，将所述片段和所述重组质粒pECXK99E-tyrB分别用KpnI和XbaI酶切后并连接得到重组质粒pECXK99E-tyrB-yahK；

将所述重组质粒pECXK99E-tyrB-yahK电击转化至突变株PE2中，获得突变株 PE3。

2.一种如权利要求1所述的构建方法构建的谷氨酸棒杆菌。

3.如权利要求2所述的谷氨酸棒杆菌在生产2-苯乙醇中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：以葡萄糖为原料进行2-苯乙醇生产。

5.一种通过权利要求2所述的谷氨酸棒杆菌制备2-苯乙醇的方法，其特征在于：所述方法包括以葡萄糖为原料，利用所述谷氨酸棒杆菌进行生物转化，制备2-苯乙醇。