[发明专利]一种将脂肪酸转化为β-羟基脂肪酸的人工生物催化剂

说明书

本发明公开了一种将脂肪酸转化为β‑羟基脂肪酸的人工生物催化剂，属于蛋白质工程领域。本发明脂肪酸β‑羟基化酶P450BSβ突变体是由野生型脂肪酸羟基化酶P450BSβ的氨基酸序列在第78位、85位、170位和290位突变得到的。本发明构建的生物催化剂能够以高度区域选择性和对映体选择性的方式氧化脂肪酸的β位C‑H基团。该生物催化剂具有高反应活性，以廉价的过氧化氢作为氧化剂，将底物C₁₁‑C₁₈链长的直链饱和脂肪酸以及油酸和亚油酸不饱和脂肪酸转化为相应的(R)‑β‑羟基脂肪酸。

技术领域

本发明涉及一种利用过氧化氢作为氧化剂将脂肪酸转化为β-羟基脂肪酸的人工生物催化剂，属于蛋白质工程领域。

背景技术

天然产生的β-羟基脂肪酸是一类重要的化合物，具有良好的生物活性。β- 羟基脂肪酸与氨基酸或碳水化合物结合后，可产生更多具有复杂结构和生物学意义的天然产物。β-羟基脂肪酸还可以用作合成β-氨基、β-内脂、β-内酰胺等多种生物活性的脂肪酸衍生物的前体。此外β-羟基脂肪酸的聚合可以提供聚羟基链烷酸酯，可以作为可降解的生物塑料。因此β-羟基脂肪酸在天然产物合成、药物的研发和生物材料中扮演者重要的角色。

目前β-羟基脂肪酸合成主要的化学方法包括线性醛的不对称醛醇缩合反应和β-酮酯的不对称氢化，但这些方法需要过度金属和复杂的催化配体或化学计量的手型助剂。利用可再生的脂肪酸资源一步氧化生成β-羟基脂肪酸是一种理想、直接且经济的制备方法。但如何在含有多个同样C-H基团的脂肪酸中进行特定位点和特定空间方向性的实施氧化无论在化学还是生物领域都极具挑战性，且至今尚未实现。

虽然枯草芽孢杆菌的P450BSβ是首个被发现的能羟基脂肪酸的酶，但野生型P450BSβ的区域选择性差，生成的1.5：1的β-和α-羟基脂肪酸。丙酮丁醇梭菌的P450CLA也可以进行羟基化，但是区域选择性更倾向于Cα位。甲基芽孢杆菌的P450MP表现出对Cβ位的偏爱，但羟基化还会在Cα位，Cγ位，Cδ位和Cε位发生，且同时产生1-烯烃。因此，脂肪酸的高区域选择性Cβ羟基化仍未解决，更不要说更具有挑战性的空间选择性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有的技术缺陷，提供一种利用过氧化氢作为氧化剂将脂肪酸转化为β-羟基脂肪酸的人工生物催化剂，制备的脂肪酸β-羟基酶P450BSβ突变体催化产生β-羟基脂肪酸，具有反应活性高、高区域和对映体选择性、体系简单、合成效率高和成本低廉等优势。

本发明通过对P450BSβ羟基化酶的定向进化实现了对脂肪酸的未活化β位 C-H键的高度区域和对映选择性地氧化。获得的P450BSβ羟基化酶突变体能够直接使用廉价的过氧化氢作为氧化剂，以C₁₁-C₁₈饱和脂肪酸和天然衍生的不饱和脂肪酸油酸和亚油酸为底物生成R型手性的β-羟基脂肪酸。该酶合成方法所获得的R型β-羟基脂肪酸产物能够作为原料通过简单的化学方法进一步转化为一系列的脂肪酸衍生物文库。这些(R)-β-羟基化脂酸以及它们的衍生物在天然产物合成、药物合成、可降解塑料、生物材料等方面有着重要的意义。为解决上述技术问题，本发明提供一种脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体，含有如SEQID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明还提供编码上述脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的核苷酸，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供包含上述脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的核苷酸的载体。

本发明还提供表达上述脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的基因工程菌。

本发明还提供一种获得脂肪酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的方法，野生型脂肪酸羟基化酶P450BSβ，将第290位的甘氨酸突变成异亮氨酸，将第170位的缬氨酸突变成异亮氨酸，将第85位的谷氨酰胺突变丙氨酸，将第78位的亮氨酸突变成丙氨酸。