[发明专利]一种高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法

说明书

本发明公开了一种高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法，所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2能够异源表达吲哚氧化酶iifC2D2；所述吲哚氧化酶iifC2D2包含了两个组分，分别是加氧酶组分iifC2和还原酶组分iifD2；通过所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2制备靛蓝的方法如下：步骤1，利用LB培养基培养所述高产靛蓝的工程菌E.coli_IifC2D2；步骤2，配制表面响应优化的色氨酸培养基；步骤3，利用步骤1中所述高产靛蓝的E.coliBL21(DE3)工程菌制备靛蓝；步骤4，得到微生物合成靛蓝粉末；步骤5，利用步骤4中得到的微生物合成靛蓝粉末染布。本发明靛蓝生产及染布的方法具有培养时间短、靛蓝产量高、合成过程绿色无毒等优势，具有优秀的工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种微生物菌种培育及其应用的技术领域，更具体地说，涉及一种高产靛蓝的工程菌制备靛蓝及其染布的方法。

背景技术

靛蓝是人类历史上使用最古老的色素之一，最早可以追溯到6000年前，具有染料活性好、色彩鲜艳持久等特点。根据相关数据统计，2017年全球靛蓝行业产能为10.5万吨，产量为8.35万吨，市场需求量巨大。靛蓝的传统合成途径是从菘蓝、马蓝、蓼蓝和木蓝等植物中提取靛蓝，但是因其存在植物种植时间长、效率低下等原因而逐渐被取代。现今，合成靛蓝的主流途径是化学合成靛蓝，有着合成效率高、产量大等优势。但同时，化学合成靛蓝途径中存在着大量的环境污染问题。靛蓝的化学合成的工业原料为苯胺，是一种有毒有害的化学品，是由石油制品苯衍生得到的。此外，合成过程涉及多种危险化学物质，包括甲醛、氢氰酸、氨基钠等。因此，寻求一种更为环保、高效的合成技术成为了目前亟需解决的问题。近年来，微生物合成靛蓝因其环境友好、反应条件温和、能耗低等优势成为了目前的研究热点。

1928年，Gray等在研究菌株降解吲哚的过程中首次发现菌株能够转化吲哚产生靛蓝类色素。此后，大量文献表明Comamonassp.、Pseudomonasputida、Arthrobactersp.等多种具有吲哚羟化能力的菌属均具有合成靛蓝的能力。通过对菌株降解吲哚的机理进行研究时，研究人员发现野生菌降解吲哚的第一步是将吲哚羟化形成吲哚酚，而吲哚酚则可以在空气中自发氧化二聚生成靛蓝。1983年，Ensley等将具有羟化吲哚能力的萘双加氧酶在大肠杆菌中异源表达，大肠杆菌体内原有的色氨酸酶将培养基中的色氨酸转化为吲哚，然后表达萘双加氧酶将吲哚最终转化为靛蓝，该实验为后续靛蓝微生物合成研究奠定了基础。此外，被证明具有羟化靛蓝能力的酶有萘双加氧酶，苯乙烯双加氧酶，黄素加氧酶和细胞色素P450单加氧酶等。1992年，美国Amgen公司对PseudomonasputidaNDO菌株的萘双加氧酶活性、稳定性和色氨酸合成途径进行改造，最终优化靛蓝产量达到135mg/L。而后在2002年，美国Genencor公司利用代谢工程的手段对此途径进行进一步改造，实现了短暂的工业化。但受限于成本等多方面因素，微生物合成靛蓝工业化最终未能实现。因此，开发更为新颖、产量更高的合成靛蓝工程菌是极其重要的。2017年，本实验室在Mol.Microbiol.(2017,106:905-918)发表了一种新颖的吲哚加氧酶，且该酶较其他芳烃加氧酶对吲哚羟化具有更优异的专一性。本实验室从长期运行的处理吲哚的SBR反应器中，筛选得到多株能够以吲哚为唯一碳源生长的菌株，这些菌株均具有不需要其他芳香化合物诱导便可以降解吲哚的能力，并在这些菌株中鉴定出了多株相似性在30％以上的吲哚加氧酶。其中，涉及的吲哚加氧酶iifC2D2来源于野生菌Burkholdeiasp.IDO3，关于异源表达吲哚加氧酶的工程菌(E.coli_IifC2D2)的构建过程及功能验证发表在Int.Biodeter.Biodegra.(2019,142:36-42)，但关于E.coli_IifC2D2在多重条件转化色氨酸合成靛蓝，并应用于染布工程的方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是研制一种更为环保、高效的可以与工业靛蓝粉相媲美的生物靛蓝合成技术，以及将生物靛蓝应用到工业染色领域的技术。