[发明专利]一种预防和治疗龋齿的生物酶及其应用

说明书

本发明公开了一种预防和治疗龋齿的生物酶，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述生物酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了所述生物酶在降解口腔致龋菌变形链球菌已形成的生物被膜及在抑制致龋菌生物被膜形成和在制备口腔护理产品中的应用。实验证实本发明所述生物酶对致龋菌变形链球菌所形成的牙菌斑有明显的水解能力，同时其与溶菌酶形成的复合物能明显促进牙菌斑生物被膜瓦解，减少生物被膜中残留活菌量，利用其制成的口香糖或咀嚼片等口腔护理产品能避免抗菌剂的使用，在龋齿预防和治疗中具有巨大应用潜力和市场前景。

技术领域

本发明涉及一种口腔护理用的酶及其产品与应用，尤其涉及一种预防和治疗龋齿的生物酶及其产品和制备方法与应用，属于口腔护理产品及其制备技术领域。

背景技术

龋齿作为一种与生活方式密切相关的疾病，已经成为人类最主要的健康问题，影响60％-90％的学龄儿童和大多数成年人，如果长期不接受治疗，将可能导致疼痛、掉牙、感染甚至引发败血症而死亡。

研究表明，口腔中有上百种细菌参与龋齿的发生，其中，变形链球菌(Streptococcus mutans)是导致龋齿发生的关键因素，这种细菌可以在牙齿表面产生生物被膜，形成牙菌斑，食物残渣发酵之后会产酸，导致牙齿表面腐蚀，进而引发龋齿。

生物被膜的主要成分是胞外多糖，其构成生物被膜的骨架，具有很强的机械强度和凝聚力，保证了生物被膜的稳定性。生物被膜的致密性和顽固性也使药物治疗面临更大的难题，且变形链球菌很强的耐药性使龋齿也因此变成顽疾，很难彻底治愈。

目前临床上龋齿治疗的方法多种多样，但是由于变形链球菌生物被膜的存在，大多数方法治疗效果不佳并且存在很多副作用，目前，市场中抗牙菌斑的产品中均含有较高浓度杀菌剂，如氯己定(0.2％)、西比氯胺(0.05％)，抗菌剂在抑制牙菌斑形成的同时也杀灭一些有益菌，容易引起口腔菌群失衡，产生耐药性，对人体健康造成不利影响。基于此，龋齿临床治疗和预防中亟需开发更加健康有效的治疗产品和应对手段。

生物酶作为一种蛋白制剂，副作用小，在龋齿临床治疗和预防中极具应用前景。申请人研究发现利用转化E.coli BL21(DE3)制备纯化的一种生物酶能有效水解变形链球菌胞外多糖，降解生物被膜，抑制牙菌斑的形成，且将其与溶菌酶制成药物复合物，可极大减小抗菌剂的使用浓度，在龋齿预防和治疗方面具有较大潜力。经检索，有关该生物酶及其产品和制备方法与应用还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种预防和治疗龋齿的生物酶及其产品和制备方法与应用。

本发明所述的预防和治疗龋齿的生物酶，其特征在于，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述生物酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述预防和治疗龋齿的生物酶的制备方法，其特征在于：将编码所述生物酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO.2连接表达载体pET-15b，引入组氨酸标签，然后转化E.coli BL21(DE3)并进行IPTG诱导表达，筛选出的菌体破碎后离心，上清液加到Ni-NTA亲和层析柱上，Ni与蛋白中引入的组氨酸标签结合，将目的蛋白挂在层析柱上，然后用洗脱缓冲液将目的蛋白竞争洗脱下来，所得目的蛋白溶液通过阴离子交换层析和分子排阻层析进一步进行纯化得到所述预防和治疗龋齿的生物酶；其中，所述洗脱缓冲液的配方是：25mM Tris pH8.0、100mM氯化钠、250mM咪唑；所述阴离子交换层析选Source 15Q HR 16/10,GEHealthcare，其所用洗脱缓冲液是25mM Tris pH 8.0，梯度浓度为0-1M氯化钠；所述分子排阻层析选Superdex200 10/300GL,GE Healthcare，其所用缓冲液为100mM氯化钠,10mMTris pH 8.0。

本发明所述预防和治疗龋齿的生物酶在降解口腔致龋菌变形链球菌已形成的生物被膜中的应用。