[发明专利]一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体的制备方法

权利要求书

1.一种用于皮肤损伤修复的含间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将间充质干细胞接种到扩增培养基进行培养；

S2：收集间充质干细胞培养基，离心去除细胞碎片，过滤去除大颗粒，得到间充质干细胞培养上清；

S3：用切向流超滤浓缩间充质干细胞培养上清，得到外泌体浓缩液；

S4：对外泌体浓缩液进行过柱处理，去除杂蛋白，得到外泌体悬液；

S5：将所得外泌体悬液中加入透明质酸钠制成间充质干细胞外泌体制剂。

2.根据权利要求1所述的一种皮肤损伤修复用的间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于：所述S1对间充质干细胞进行培养时，采用无血清细胞培养基。

3.根据权利要求1所述的一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于：所述S2步骤中在细胞培养上清浓缩过程中，先后使用0.45μm和0.22μm滤膜过滤；

4.根据权利要求1所述的一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于：所述S3步骤中超滤膜截留物质分子量大于5KD，上清液浓缩倍数为20倍；

5.根据权利要求1所述的一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于：所述S4步骤中使用的外泌体分离柱为35nm+色谱柱，能过滤35nm以下的杂蛋白；

6.根据权利要求1所述的一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于：所述S5步骤中透明质酸钠的浓度为1％-5％。

7.一种鉴定权利要求1的方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)透射电镜观察外泌体形态：将载样铜网固定在支架上，将样本滴加到铜网上室温静置，在铜网一侧用滤纸将液体吸去，滴加磷钨酸溶液对样本进行负染，用滤纸吸去负染液，将铜网转移至透射电子显微镜下，观察外泌体形态。

(2)纳米粒子分析系统检测外泌体的粒径和浓度；

(3)western blot检测外泌体特异性表面标志物CD9、CD63和HSP70的表达：提取外泌体总蛋白，经化学发光成像分析仪观察条带显影情况。