[发明专利]一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的方法

权利要求书

1.一种检测血清中5-羟色胺和褪黑素浓度的方法，其特征在于，

所述5-羟色胺和褪黑素对应的内标物分别为：5-羟色胺-d4和褪黑素-d4；

采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的5-羟色胺和褪黑素，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述5-羟色胺和褪黑素的含量，具体色谱条件为：

（1）超高效液相色谱条件：

流动相A：0.1%甲酸-2mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇；

色谱柱型号：Waters BEH C18；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为90:10；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至2:98；在1.5-3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在3.5-5.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至初始比例；每个样品采集时间为5.5分钟；

所述经过预处理的血清按照如下方法制备：取200 μl血清于1.5 ml离心管中，向其中加入20 μl内标工作液，20μl 0.2M碳酸钠溶液以及 900μl甲基叔丁基醚，振荡3~10 min后，在12000~15000 r/min，4~20℃的条件下离心4~10 min；再取850μl上清液经氮气流吹干后与80μl 50%甲醇水溶液混合，振荡1~5 min后，在12000~15000 r/min，4~20℃的条件下离心1~5 min，取上清液待进样；

（2）质谱条件：

在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为0.5kV；离子源温度为150℃；脱溶剂温度为400℃；脱溶剂气流速为800L/hr；锥孔气流速为150L/hr；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流速为0.2~0.4ml/min；柱温为30~50℃；进样体积为1~10µL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，流速为0.3ml/min；柱温为40℃；进样体积为5µL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血清为人或动物的血清。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述内标工作液按照如下方法制备：

以甲醇水溶液配制如下内标母液：5-羟色胺-d4 1mg/ml，褪黑素-d4 0.01mg/ml；

分别移取各内标母液：5-羟色胺-d4 10μl，褪黑素-d4 4μl；再加入至986μl 50%甲醇水溶液中得到1ml混合内标溶液；

取10uL上述混合内标溶液加入至0.99ml纯甲醇中，即得内标工作液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述标准品按照如下方法制备：

将5-羟色胺和褪黑素配制成如下浓度的标准品母液：5-羟色胺1mg/ml，褪黑素0.01mg/ml；

分别移取各标准品母液：5-羟色胺20μl，褪黑素2μl；再加入至978μl 50%甲醇水溶液中得到1ml混合标准储备溶液；

将上述混合标准储备溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述空白血清基质为5%~15%甲醇水溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：

5-羟色胺的七个浓度点为依次为：1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml；

褪黑素的七个浓度点为依次为：0.001ng/ml、0.0025ng/ml、0.005ng/ml、0.025ng/ml、0.05ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述空白血清基质为10%甲醇水溶液。