[发明专利]一种抗虫基因和耐草甘膦基因表达载体及其应用

说明书

本发明公开了一种抗虫基因和耐草甘膦基因表达载体及其应用，所述表达载体含有抗虫基因cry1Ab、抗虫基因cry2Ae和耐草甘膦基因cp4。本发明在cry2Ae基因前面加了叶绿体信号肽序列，一方面增加了Cry2Ae蛋白的表达量，增加幅度为20％‑100％；另一方面，降低了高表达量的Cry2Ae蛋白对植物生长发育造成的干扰。同时，本发明载体同时表达Cry1Ab、Cry2Ae和Cp4蛋白，用该载体转化农作物获得的转基因作物能够同时抗草地贪夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等农作物的主要鳞翅目害虫，扩宽了转基因作物的抗虫范围，而且能有效延缓害虫抗性的产生，同时使转基因作物具有抗草甘膦的能力。

(一)技术领域

本发明属于转基因植物新品种培育领域，具体涉及同时高效表达两种抗虫基因和一种耐草甘膦基因的表达载体及其在培育抗虫耐草甘膦的植物细胞、植物方面的应用。

(二)背景技术

全球人口迅速增长带动了粮食需求的大量增加。事实上，通过常规的品种改良和栽培技术改进，特别是杀虫剂的使用，粮食生产在过去几十年已经明显提高。上世纪60年代兴起的细胞遗传学和细胞生物学技术引发了“绿色革命”，使粮食作物的产量显著提高、抗病性和抗虫性明显增强。然而，这些技术的广泛采用也同时给环境和人类健康带来一些新的问题，如农药和化肥的使用导致土壤侵蚀加剧。同时，在这些技术使用20年后，对粮食增产的贡献也明显减少。为克服这些问题，来自于政府、大学、研究机构及公司的科学家们正在寻求新的技术和方法。随着DNA技术的迅速发展，到上世纪80年代科学家们已经开发出一些新的现代育种技术和方法，其中利用农杆菌介导转化和基因枪转化的转基因技术是最为成功的一项。

随着生物技术的发展以及各国对生物技术领域投入的加大，使得全球育种家和生物技术研究机构能够突破传统的育种框架和育种年限来培育新的植物品种。1995年美国批准了转基因抗虫棉的商业化种植批准，1996年转基因抗虫棉开始推广，中国也在1996年开始引入转基因抗虫棉。2019年-2021年，我国陆续首次审批了抗虫耐除草剂玉米和大豆的农业转基因生物安全证书，标志着我国转基因生物育种技术进入加速期。另外，草地贪夜蛾作为一种杂食性害虫已经于2018-2019年从云南入侵我国，这种害虫危害性大、耐药性强，目前已经对我国的玉米等作物造成严重危害，通过生物育种的方法来防治草地贪夜蛾等害虫迫在眉睫。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种常见的革兰氏阳性土壤微生物，它能产生一种对特定生物具有高度选择性的杀虫蛋白。对Bt蛋白已进行了数十年安全性试验证实，它对人类和动物不具毒性。cry1Ab基因是从苏云金芽孢杆菌HD-1菌株克隆得到的，其表达产物Cry1Ab蛋白在鳞翅目害虫中具有广谱的杀虫活性(Hfte H and WhiteleyH R.Microbiological Reviews,1989,53(2):242-255.；van Frankenhuyzen K.JInvertebr Pathol.2009,101(1):1-16)。截至2012年1月，共有近70种Cry2蛋白被鉴定出来，涵盖了从Cry2Aa至Cry2Ai共9小类，并以Cry2Ae类占绝大多数，Cry2Ae蛋白仅对鳞翅目昆虫有毒杀作用，且Cry2Ae对美洲棉铃虫的毒力要高于Cry2Aa(Zheng A etal.Ann.Microbiol.2010,60(1):129-134)。虽然Cry2蛋白分子量比Cry1小，但相对Cry1毒素而言，Cry2对鳞翅目的杀虫范围更广，与Cry1之间存在不对称交叉抗性，在农业害虫防治方面具有更大的应用前景。近年来，以转cry2Ae单价基因或cry2Ae+cry1Ac双价基因为主的第二代转基因植物正逐渐取代以转cry1A类基因为主的第一代转基因植物以缓和目标害虫对抗虫植物的适应以及抗性风险等问题，如转基因棉花Bollgard II(Tabashnik B E etal.Appl.Environ.Microbiol.2002,68(8):3790-3794.)。Cry1Ab与Cry2Ae蛋白功能区域的氨基酸相似度极低，仅为17.9％。因此，二者的杀虫谱差异很大，也不容易产生交付抗性，非常适合联合使用。