[发明专利]一种几丁质酶、其编码基因及应用

说明书

本发明公开了一种几丁质酶、其编码基因及应用。本发明以弧菌Vibrio sp.MCCC1A18305的基因组DNA为模板，设计并合成引物，通过PCR扩增几丁质酶基因，将该基因克隆入pET‑22b表达载体上，在大肠杆菌E.coli BL21中进行诱导表达，采用Ni‑Sepharose亲和层析纯化得到较高纯度的重组几丁质酶蛋白。该酶最适pH为6.5，最适温度为50℃，在40～50℃、pH 5.5～6.5范围内酶活性较好；在40℃和45℃下保温12h后酶活力仍无明显降低；Ca²⁺和K⁺对该酶活性具有明显促进作用；该酶对胶体几丁质具有良好的底物特异性，其水解终产物主要是二糖和单糖，是一种外切型几丁质酶，可用于几丁质资源的开发利用和几丁寡糖的制备。

技术领域

本发明涉及采用基因工程手段获得一种几丁质酶及其制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

几丁质是由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)通过β-1,4糖苷键连接形成的高聚物，在自然界中的含量仅次于纤维素。几丁质广泛存在于多种生物体中，如足纲动物的外骨骼、甲壳类动物外壳、真菌细胞壁等，是一种非常丰富的自然资源。全球生物生命活动每年会产生大约100亿吨的几丁质，其中海洋中每年可生物合成几丁质约10亿吨，虾和蟹作为海洋中最常见的甲壳类生物，它们的外壳中含有丰富的几丁质，是海洋几丁质的主要来源之一。天然几丁质性质稳定、溶解性差，不易被直接利用。尤其近年来，海水养殖和淡水养殖虾蟹快速发展使得几丁质产量剧增，餐桌残留几丁质未被充分利用而造成资源浪费，大量几丁质堆积还造成严重的环境污染问题。几丁寡糖是几丁质降解后形成的低聚合度(DP10)的寡糖，因其具有良好的抗肿瘤、抗炎症、抗病毒以及抗菌功能而广泛应用于医药行业。此外，几丁寡糖因其能够提升机体免疫力、细胞修复、促进肠道益生菌增殖和抗氧化功能而被应用于食品和保健品行业。在农业中，几丁寡糖也被用作植物生长促进因子，增强植物抵抗力。目前降低几丁质聚合程度的方法主要是化学法和生物酶法，但是化学方法成本高，污染大且产物质量不稳定，最终的产率低而高耗能。而生物酶法降解难溶几丁质是一种较其它化学和物理方法更加安全可靠的一种措施，采用此法得到的低聚糖产物纯度更高，结构稳定，且不会造成环境危害。微生物中含有丰富的几丁质酶资源，微生物几丁质酶分为内切型和外切型两种，可将几丁质降解为不同聚合度的几丁寡糖，利用微生物几丁质酶降解几丁质生产几丁寡糖具有非常重要的实际意义。

发明内容

本发明的主要目的是针对现有技术的不足，提供一种几丁质酶(命名为VBCH01)。

编码该酶的核苷酸序列如下：(SEQ ID NO:1)

其中5’端66bp片段为编码信号肽序列。

该酶的氨基酸序列如下：(SEQ ID NO:2)

其中，N端22个氨基酸为信号肽序列。

本发明的另一目的，在于提供一种几丁质酶的制备方法，它包括如下步骤：

(1)基于弧菌(Vibrio sp.MCCC 1A18305)基因组测序数据分析获得几丁质酶基因VBCH01。

(2)设计并合成扩增去除信号肽编码序列的几丁质酶基因VBCH01的引物，其序列如下：

上游引物VBCH01F:5’-CGCGGATCCGCCTTCAGCTCCGTCAATCGA-3’(SEQ ID NO:3)

下游引物VBCH01R:5’-CCGCTCGAGAGGCGTCTGGCACTCGGCC-3’(SEQ ID NO:4)。