[发明专利]一种多重信号放大系统及其在酶联免疫斑点法检测中的应用

说明书

本发明涉及一种利用多重信号放大系统进行酶联免疫斑点法的检测的方法，包括下述步骤：(1)固相基质上固定包被抗体或者抗原；(2)加入待检测细胞，或同时加入待检测细胞和细胞刺激物，作用一段时间；(3)加入抗体‑DNA/RNA连接链或者加入抗原‑DNA/RNA连接链，作用一定时间；(4)加入DNA/RNA放大链，作用一定时间；(5)加入连接有修饰物a的DNA/RNA检测链，反应一定时间；(6)加入连接有结合物b的酶；(7)加入酶的底物；(8)定量分析固相基质上所形成的具有检测信号的免疫斑点的数量。本发明检测方法具有信号多重放大、检测限低、灵敏度更高、操作简便等优点。

技术领域

本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种基于DNA/RNA互补配对的多重信号放大系统及其在酶联免疫斑点法检测中的应用。

背景技术

免疫斑点法是指将抗体结合到PVDF、醛基化多孔板等固相载体上，然后利用抗原抗体特异性结合检测细胞所分泌的细胞因子等物质的免疫学检测方法。酶联免疫斑点法(ELISPOT)是最常用的免疫斑点法，通过显色反应，在待检测细胞分泌可溶性蛋白等物质的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在仪器下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌特定物质的细胞的数量。传统的ELISPOT检测方法的检测灵敏度受限于酶和底物显色时的放大效果。为了提高传统ELISPOT检测方法的灵敏度，本发明采用DNA互补配对及相应的放大系统制备了一种检测灵敏度高的多级多重信号放大系统，并将其应用于酶联免疫斑点法的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行酶联免疫斑点法检测的方法，包括下述步骤：

(1)固相基质上固定包被抗体或者抗原；

(2)加入待检测细胞，或同时加入待检测细胞和细胞刺激物，作用一段时间；

(3)去除待检测细胞和/或细胞刺激物并洗涤；加入抗体-DNA/RNA连接链或者加入抗原-DNA/RNA连接链，作用一定时间；

(4)加入DNA/RNA放大链，作用一定时间；

(5)加入修饰物a修饰的DNA/RNA检测链，反应一定时间；

(6)加入可与修饰DNA检测链上的修饰物a特异性结合的结合物b连接的酶；

(7)加入酶的底物进行反应；

(8)定量分析固相基质上所形成的具有检测信号的免疫斑点的数量。

本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，在固相基质上包被抗体或抗原后，加入封闭液进行封闭。

本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述待检测细胞包括但不限于人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒的任一种或其组合。

本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述细胞刺激物为与细胞作用后可使细胞分泌抗原或抗体的物质。

本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述待检测细胞为未经刺激物刺激的待检测细胞，或已经和刺激物作用过的待检测细胞。

本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗体或抗原通过连接中间体与DNA/RNA连接链连接时使用可行的连接基团。

本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述抗体/抗原-DNA/RNA连接链中，每个抗体/抗原分子连接一个或多个连接中间体。

本发明优选的技术方案中，所述抗体或抗原与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或其组合。

本发明优选的技术方案中，所述DNA/RNA连接链与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或其组合。