[发明专利]一种检测和分析单细胞转录组测序数据中病毒表达量的方法

说明书

本发明公开了一种检测和分析单细胞转录组测序数据中病毒表达量的方法，利用scRNA‑seq技术对病毒感染过程中病毒转录定量和病毒与宿主的相互作用进行研究。该方法能够分析宿主细胞中病毒转录本的覆盖度、病毒感染后整体和单个细胞中病毒整体转录和单基因表达量的精确定量，并可进一步分析病毒基因与宿主基因的共表达模式，对特定病毒感染宿主的机制解析以及特异性疫苗和药物的研发有着重要的意义。

技术领域

本发明涉及单细胞转录组测序、病毒感染与宿主免疫反应和生物信息学分析领域，具体涉及一种基于高通量单细胞转录组测序技术检测和分析单个细胞中病毒基因表达量的方法。

背景技术

高通量测序技术的出现取代了传统芯片技术，被广泛应用到各个领域中并得到了长足的发展。基于大块组织的传统转录组测序技术(RNA-seq)获得的是一个细胞群体的基因表达均值，比较适合研究细胞组成均一的系统。但是生物样本和组织往往是一个细胞类型多样的十分复杂的异质性系统，传统RNA-seq技术在研究此类问题时会显现出明显的不足，因此基于单细胞的转录组测序技术(single-cell RNA-sequencing,scRNA-seq)应运而生。

2009年，scRNA-seq技术首次被报道，从此生物学研究领域进入了单细胞的时代。在 scRNA-seq技术刚出现的几年中，由于实验操作的繁琐和花费的昂贵，scRNA-seq技术并没有在生物学研究的各个领域如火如荼的开展。一直到2014年之后，因为新的测序技术和方案的出现，使得scRNA-seq的花费和操作复杂性发生了明显的下降，scRNA-seq技术才开始真正在各个研究领域崭露头角。随着技术的方便与成熟，以及花费的降低，单细胞测序研究的论文中细胞数量也达到了井喷式增长，从开始的几百几千个细胞，发展到现在的几十万甚至上百万个细胞数量级。目前的技术根据转录本富集定量的策略的不同大体上可以分为两大类： (1)基于全长的转录本测序(Full-length transcript sequencing)，代表性技术为Smart-seq2技术。通过捕获全长转录本进行RNA-seq测序，使得基因表达的定量更加准确和灵敏。但是该技术操作相对麻烦，通量比较低，并且造价相对也较高；(2)基于3’或5’端的转录本测序，目前使用最多的是10x Genomics公司的Chromium技术。因为只测序转录本的一端，因此价格相对便宜，细胞通量也很高。缺点是转录本定量需要依据特异性分子标签(Unique molecular identifier，UMI)，因此基因表达定量的准确性和灵敏度都有所降低。

病毒是一种不具有细胞结构的生命形态，其由蛋白质外壳和内部遗传物质组成(包括 DNA或RNA)。病毒本身无法复制和繁殖，只有通过感染特定宿主细胞并利用宿主细胞的生物分子合成自己的遗传物质才能实现大量复制繁殖。病毒感染性疾病是目前威胁人类健康的主要杀手之一。例如人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染可以直接摧毁人类免疫系统，引起艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)；狂犬病毒(Rabies virus，RABV)是一种神经感染病毒，发病率接近100％，发病后至今没有有效的药物和治疗手段；COVID-19由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起，是一种急性感染性肺炎，患者以肺部病变为主。与此同时，病毒在多种人类恶性肿瘤的发生进程中扮演了重要角色，塑造了宿主-病毒互作关系中的肿瘤行为。例如EBV于1964年被M.A.Epstein和Y.M.Barr首次从BL(Burkitt’ s lymphoma)患者肿瘤细胞中发现，是第一个被鉴定的跟人类肿瘤相关的病毒，属于γ-孢疹病毒家族成员。全世界大于90％的成人是EBV病毒感染携带者，它跟多种肿瘤疾病尤其是淋巴瘤和上皮癌症的发生相关，例如鼻咽癌、胃癌、NK细胞瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金病和柏基特淋巴瘤等。