[发明专利]一种微量细胞原位微反应器及制备与应用

说明书

本发明涉及一种微量细胞原位微反应器的制备及其应用，通过对毛细管内壁进行硅烷化处理，并通过自由基聚合反应在其表面修饰环氧基团，制备成毛细管开管柱，然后通过共价键合依次修饰聚乙烯亚胺和碘乙酸‑N‑琥珀酰胺酯，制备成固相烷基化毛细管微反应器。本发明的优点是原位进行蛋白质组样品处理，有利于减少传统样品处理过程中多步转移导致的样品损失，因此，该固相烷基化开管柱适合于微量样品的蛋白质组预处理。此外，本方法耐受各种表面活性剂和强裂解试剂，具有较好的样品兼容性。

技术领域

本发明涉及一种微量细胞原位微反应器，可应用于1-100个细胞、微量体液和组织样本的蛋白质高效预处理。

背景技术

传统的基于bottom-up的蛋白质组学样品处理流程通常包括蛋白质的提取、变性、还原、烷基化、脱盐和酶解等，这些操作通常在离线条件下完成，并且需要多步转移，蛋白质样品损失难以避免。此外，大多数蛋白质组学样品处理方法采用去污剂或尿素裂解细胞(JProteome Res,2015,14:3403-3408)，由于这些化学物质与质谱不兼容，需在LC-MS分析前将其去除。为了解决上述问题，Wisniewski等人开发了滤膜辅助的样品制备(FASP)方法，在单个容器超滤管中进行样品制备，通过离心去除表面活性剂和其他低分子量的污染干扰物。他们通过采用FASP可以从500个HeLa细胞中鉴定出905种蛋白质(J Proteome Res,2011,10:3040-3049)，然而，该方法的回收率通常只有50％-80％，因此限制了其在痕量样品处理中的应用。

为了解决上述问题，我们制备了一种微量细胞原位微反应器，在开管柱内进行原位的蛋白质组样品预处理，同时实现其它干扰试剂(如裂解试剂、表面活性剂、还原剂等小分子)的快速去除，开管柱的限域效应还有利于提高蛋白质的反应效率，为微量细胞蛋白质组的高效处理与分析提供重要手段。

发明内容

本发明涉及一种微量细胞原位微反应器的制备及其应用，通过对毛细管内壁进行硅烷化处理，并通过自由基聚合反应在其表面修饰环氧基团，制备成毛细管开管柱，然后通过共价键合依次修饰聚乙烯亚胺和碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，制备成固相烷基化毛细管微反应器。将该微反应器用于1-100个细胞中微量蛋白质组的样品处理，具体处理过程如下：首先，分别将细胞裂解液和细胞混悬液依次通入微反应器内，形成“裂解液-细胞-裂解液“三明治结构。然后，通过超声破碎使微反应器内的细胞裂解；同时，在高温条件下，快速实现蛋白质的变性、还原和烷基化反应，使蛋白共价固定在微反应器的内表面；最后，采用甲醇和碳酸氢铵等溶剂清洗微反应器，以去除表面活性剂、脂和糖类等干扰物质；加入适量蛋白酶，在适当温度下进行酶解。酶解产物可直接进行液相色谱-质谱分析。本发明的优点是原位进行蛋白质组样品处理，有利于减少传统样品处理过程中多步转移导致的样品损失，因此，该固相烷基化开管柱适合于微量样品的蛋白质组预处理。此外，本方法耐受各种表面活性剂和强裂解试剂，具有较好的样品兼容性。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

(1)采用内径为100-200μm的带有聚乙酰亚胺涂层的石英毛细管，首先活化毛细管以暴露出其内壁的羟基，依次采用氢氧化钠、盐酸和甲醇对毛细管进行碱洗、酸洗和醇洗，氢氧化钠和盐酸的浓度均为1-2M。

(2)对上述毛细管进行硅烷化处理，在其内表面引入双键，进而与甲基丙烯酸单体共聚。采用的硅烷化试剂为3-(甲基丙烯酰氧基)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)或乙烯基三甲氧基硅烷(VMTS)，浓度体积比为50％-100％。