[发明专利]一株耐受重金属微生物菌株及其应用

说明书

本发明属于重金属污染土壤的生物‑生态修复技术领域，具体涉及一株耐受重金属微生物菌株及其应用。本发明假单胞菌于2021年4月23日在中国微生物菌种保藏管委会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22233，经鉴定为台湾假单胞菌(Pseudomonastaiwanensis)。该菌株筛选自刁泉铜尾矿区土壤中，该菌株杆状，周生鞭毛，能运动，革兰氏阳性菌，可用于重金属污染土壤中的Cu、Cr、Cd、Pb和Zn的沉淀固化。

技术领域

本发明属于重金属污染土壤的生物-生态修复技术领域，具体涉及一株耐受重金属微生物菌株及其应用。

背景技术

重金属是典型的土壤污染物，具有隐蔽性、难降解、移动性差和易被富集等特点，可影响土壤微生物区系、生态物种和微生物过程，进而影响生态系统的结构与功能。土壤重金属污染是土壤生态治理的重点与难点，目前对于土壤重金属的修复方法主要是通过清除或固定污染物，减少其迁移性和生物可利用性，传统的修复方法包括：①以客土、翻土、去表土为主的工程治理方法；②以磷酸盐类、黏土矿物类、有机类的沉淀、吸附、络合、氧化还原等为主的化学固定技术；③以植物提取、固定、挥发、过滤为主的生物修复。但是，这些修复方法成本高、时间长、工程量大，土壤再利用程度低。因此如何开展重金属污染场地原位修复是近年来国内外广泛关注的热点领域。

发明内容

针对上述问题本发明提供了一种耐受重金属微生物菌株及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

本发明假单胞菌于2021年4月23日在中国微生物菌种保藏管委会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22233，经鉴定为台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)。该菌株筛选自刁泉铜尾矿区土壤中，该菌株杆状，周生鞭毛，能运动，革兰氏阳性菌。菌落表面粗糙不透明，微黄色，需氧菌。其最适生长条件为：pH 7.2-7.5，温度30-35℃。所用培养基为LB培养基(NaCl 10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L固体培养基还需要加入琼脂粉12g/L，pH7.4)。

本发明假单胞菌的分离方法，包括以下步骤：

土壤菌悬液的制备和菌株分离：将样本土样过100目的筛，除去大块沙土，称取土样10g，加入装有90mL无菌水，摇床30min左右，使得土壤中的微生物与水样混合均匀，配置土壤悬液的浓度为0.1g/L，在超净工作台中取土壤悬液进行浓度梯度稀释，用灭菌枪头吸取1mL的0.1g/L土壤悬液，加入到9mL的无菌水中，如此稀释10^-6。

重金属铜的梯度平板配置：配制200mL的LB固体培养基，同时再将适量的重金属分别加入配置好的100mL液体培养基中，再加入1.2g的琼脂，121℃，灭菌20min。灭菌完成后，一般先将培养皿一侧搁高约5mm，倒入约10mL融化的不含金属离子的培养基，待凝固后放回水平位置，再倒上等体积含金属离子的培养基，放置一天后，即成重金属梯度平板。

吸取1mL的土悬液加入重金属梯度平板，进行涂布，37℃培养24-48h，观察菌落的生长情况，在重金属浓度较高处挑选出菌落形态不同，生长良好的菌落，于含有重金属的LB固体培养基上进行划线分离纯化，一直到筛选到菌落特征一致的单一菌落；

将上述所得到的单一菌落转接至LB斜面培养基，37℃培养箱中培养24h，将所有的斜面试管取出，放于4℃冰箱中保存备用。选取分离、纯化后所得的斜面菌种，分别接种于不同重金属(Cu、Cr、Cd、Pb和Zn)的LB液体培养基中，将在上述含有重金属LB培养基中生长良好的菌株定为初选菌株。

将初选菌株的培养液进行离心，测定上清液中重金属的浓度，发现LQCu菌株的沉淀效率都在85％以上。

一株耐受重金属微生物菌株的应用，用于重金属污染土壤中的Cu、Cr、Cd、Pb和Zn的沉淀固化。