[发明专利]一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用

说明书

本发明公开一种重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用。针对现有重组表达RBP4蛋白复兴不可控、免疫原性不强、性能不稳定，免疫动物获得的抗体性能不佳等情况，本发明通过对RBP4蛋白氨基酸的替换获得突变重组RBP4蛋白，利用PCR技术得到重组RBP4基因，将重组RBP4基因进行双酶切连接到经过双酶切的载体上获得表达载体，再将表达载体转化大肠杆菌Origamin B感受态细胞得到RBP4表达菌株，纯化后获得重组RBP4。本发明制备的重组RBP4具有天然蛋白的生物活性，其稳定性与免疫原性都优于未突变重组蛋白，并且可应用于RBP4抗原和抗体的制备中。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种原核表达重组视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用。

背景技术

视黄醇结合蛋白(Retinol-binding Protein，RBP)是在体内负责结合并转运维生素A视黄醇类活性代谢物的一类蛋白质。视黄醇结合蛋白4(RBP4)基因位于10q，mRNA全长914bp，由181个氨基酸组成，相对分子质量为21kD，是视黄醇结合蛋白家族中的分泌型RBP，是一种单一肽链的运载蛋白，有一个位点特异结合一分子维生素A，可将维生素A从肝脏中转运至靶器官，并可实现维生素A的细胞内转运代谢，RBP4在协助维生素A发挥生理功能中起着重要作用。

目前，用于临床血清RBP4检测的方法主要包括放射性免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫速率散射比浊法、微球捕获酶免疫法(MEIA)等。这些方法中都需要用到不同或一定浓度的RBP4抗原作为标准品制作标准曲线，从而计算样品中RBP4的含量。国内禁止买卖人血清，从国外购买RBP4成本昂贵且来源有限，发展重组RBP4代替人源RBP4非常有必要。目前重组表达的RBP4蛋白是包涵体表达，存在变性与复兴过程，复兴是不可控的，大大地限制了RBP4的应用，不经突变的RBP4免疫原性不强，免疫动物获得的抗体性能不佳。而重组突变表达的可溶性RBP4不仅具有天然蛋白结构与生物活性，其稳定性与免疫原性都优于天然蛋白，可以应用到体外诊断行业中。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用原核表达系统表达的具有天然蛋白的生物活性且稳定性与免疫原性都优于未突变重组蛋白的可溶重组突变视黄醇结合蛋白4及其制备方法和应用。

本发明具体技术方案如下：

一种重组视黄醇结合蛋白4，所述蛋白具有如序列表SEQ ID NO.1、2或3所述的氨基酸序列。

一种上述重组视黄醇结合蛋白4的基因，所述基因具有如序列表SEQ ID NO.5、6或7所示的核苷酸序列。

一种重组载体，所述载体含有上述重组视黄醇结合蛋白4的基因。

一种上述重组视黄醇结合蛋白4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S10：对视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列进行氨基酸的替换，得到突变氨基酸序列；

S20：用大肠杆菌优势密码子将突变氨基酸序列反向翻译成核苷酸序列，并通过PCR技术，得到重组视黄醇结合蛋白4基因；

S30：将重组视黄醇结合蛋白4基因进行双酶切，并连接到经过双酶切的载体上，得到表达载体；

S40：将表达载体转化大肠杆菌Origamin B(DE3)感受态细胞，得到视黄醇结合蛋白4表达菌株，进行培养、诱导表达、纯化，获得所述重组视黄醇结合蛋白4。

进一步地，所述视黄醇结合蛋白4的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述突变氨基酸序列和核苷酸序列为SEQ ID NO.1和5、SEQ ID NO.2和6、SEQ ID NO.3和7中的一组或者多组。