[发明专利]一种促进干细胞体外增殖和分化的培养方法

说明书

本发明属于干细胞培养技术领域。更具体地，涉及一种促进间充质干细胞体外增殖和分化的培养方法及采用的无血清培养基；每1L所述无血清培养基包含：血小板裂解物1～5％；银耳多糖混合物3～10mg/mL；二氢硫辛酸0.1～0.2％；基础培养基补足。本发明提供的无血清培养基采用人血小板裂解物替代胎牛血清，无批次间差异，大大提高了间充质干细胞临床应用的安全性问题。本发明提供的无血清培养基以低浓度的人血小板裂解物复合特定分子量组合的银耳多糖及二氢硫辛酸，即可满足间充质干细胞的体外传代连续培养。试验结果表明，采用本发明提供的无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞形态均一，且均能诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞，细胞表面标志物表达符合标准，增殖效率高，培养效果与10％胎牛血清培养无明显差异。

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域。更具体地，涉及一种促进干细胞体外增殖和分化的培养方法及采用的无血清培养基。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种来源于发育早期中胚层的多能干细胞，广泛存在于各种机体组织如骨髓、脂肪、脐带、胎盘等，并且具有自我更新和多向分化潜能以及独特的细胞因子分泌功能。间充质干细胞在不同的诱导条件下可分化为骨髓基质细胞、成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞。间充质干细胞还具有免疫调节功能和促再生特性，在不同的疾病领域有临床应用报道，包括骨和软骨修复、呼吸道、心血管和肝胆等方面的疾病应用。

传统的人间充质干细胞的培养方法多采用添加10％胎牛血清(Fetal bovineserum,FBS)的培养基，但是含有动物血清的培养方法普遍存在以下不足：①动物血清作为异种血清，存在免疫排斥反应；②动物血清可能含有致病因子和外源毒物，如病毒和脘病毒的传播，安全性较低；③血清不同批次间存在质量差异；④血清中含有大量外泌体，不能用于人脐带间充质干细胞外泌体的分离和提纯。上述不足大大增加了间充质干细胞临床转化的困难，因此，无血清培养体系得以建立。

无血清培养基具有成分明确稳定，制备简单的优点，可以弥补有血清培养基的缺陷，但是，使用目前的无血清培养基培养的间充质干细胞形态、表面抗原、诱导分化能力、增殖速率及干性标志物与有血清培养存在一定的差异。总得来说，目前组合配制的化学成分限定的无血清培养体系还不能完全达到血清培养的效果。

血小板裂解物含有许多不同的生长因子，能够对细胞起到支持生长的作用，也是当前使用较多的一种血清替代物。有研究表明，血小板裂解物能够很好的维持间充质干细胞的干性，使其在体外能够连续传代，且传代的间充质干细胞具有良好的形态、细胞表型和分化潜能。

银耳多糖是一种存在于银耳深层发酵孢子体中的酸性杂多糖，其主链结构是由α-(1→3)糖苷键连接的甘露聚糖，支链由葡萄糖醛酸和木糖组成。目前银耳多糖已经被应用于成骨细胞的体外培养(中国专利申请CN106434549A)、牙髓干细胞的分离及培养(中国专利申请CN109897821A)，显示其与某些组分的特定配合能够降低细胞发生凋亡的概率。

二氢硫辛酸(DHLA)以化合物的形式广泛存在于各种原核细胞和真核细胞中，参与能量代谢。多项研究表明，二氢硫辛酸具有强大的抗氧化能力，其可以将DSSH还原成GSH，同时还可以通过氧化还原偶联再生其他内源性抗氧化剂，如VE、辅酶Q₁₀以及LA，因此具有很强的自由基和活性氧清除能力，对细胞核和细胞膜具有保护作用。

目前，未见将血小板裂解物、银耳多糖及二氢硫辛酸作为添加成分联合用于体外培养间充质干细胞并维持其干性的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有间充质干细胞培养存在的缺陷和不足，提供一种适用于体外培养间充质干细胞的方法，该培养方法关键技术点在于采用了含血小板裂解物、银耳多糖及二氢硫辛酸功能成分的无血清培养基，经试验证明，该无血清培养基培养获得的间充质干细胞经连续传代后仍然具有非常好的新盖、细胞表型和分化潜能，培养效果相当于10％FBS连续培养效果，证明其完全可以取代血清培养。