[发明专利]一种抗菌肽BMAPM及其表达方法和应用

说明书

本发明公开了一种抗菌肽BMAPM及其表达方法和应用，属于生物医药领域。本发明以牛源Cathelicidins家族的抗菌肽为出发序列，通过人工设计螺旋结构氨基酸序列获得抗菌肽BMAPM，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其杀菌能力与天然抗菌肽相比大大提高。本发明制备抗菌肽BMAPM方法是以酵母为表达宿主，通过在其C端融合荧光蛋白，并通过简并引物随机突变抗菌肽的N端序列，再由流式细胞仪分选荧光强度高的突变株，即筛选抗菌肽高表达的突变株。本发明为高效表达和检测抗菌肽提供了新的方式。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种抗菌肽BMAPM及其表达方法和应用。

背景技术

传统抗生素的滥用导致耐药性微生物不断增多，从而导致很多疾病的治疗变得更为困难，而新抗生素的发现周期相对较长，短期内很难挖掘效果显著的新抗生素。但人们发现在机体遭受微生物感染后，可以迅速产生大量的具有抗菌活性的小分子多肽，即为抗菌肽，参与机体免疫。这些机体自身免疫产生的抗菌肽的发现为新型肽类抗生素的发现提供了丰富的资源，并有望解决传统抗生素长期使用带来的微生物耐药性问题。从而在医药卫生、农业生产、食品工业、保健品、洗护用品等领域都是最佳的防腐剂、保鲜剂的候选名单，具有广阔的应用前景。

目前哺乳动物细胞合成的抗菌肽主要分为两类：Defensins和Cathelicidins，其中Cathelicidins家族的抗菌肽的结构主要分为4种：α螺旋结构、β片层结构、延伸螺旋结构和环状结构等。牛源抗菌肽等大部分哺乳动物抗菌肽都属于α螺旋结构，即在其N端是由带正电荷的氨基酸和疏水性氨基酸组成α螺旋结构，而在C端由一段疏水性的氨基酸残基构成，其中N端的α螺旋结构在杀菌过程中起决定性作用。带正电荷的氨基酸通过静电作用力与细胞膜表面带负电荷的磷酸分子相结合，在此基础上，由疏水性氨基酸将抗菌肽插入细菌细胞膜中，破坏细胞膜电位、改变膜通透性并导致代谢物的渗漏，最终导致细菌死亡。

为了增强抗菌肽的抗菌作用与免疫调节作用，缓解各类菌种日益增强的耐药性，科学家们正在寻找更多设计合成或改造天然抗菌肽的方法。

此外，随着合成生物学技术及蛋白质表征技术的发展，利用微生物细胞异源表达异源蛋白基因成为一种流行趋势，然而不同宿主适合表达的蛋白有限，且基本都有一定的密码子偏好性。然而对于蛋白类化合物而言，目前可用的检测手段比较有限，一般采用SDS-PAGE、高效液相色谱或者高效液相色谱/质谱联用的方法进行检测，而上述三种检测手段方案复杂，不利于高通量检测蛋白的表达量。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种抗菌肽BMAPM。本发明还要解决的技术问题在于提供表达所述BMAPM的具体方法。本发明最后要解决的技术问题在于提供所述BMAPM的具体应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种抗菌肽BMAPM，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码所述的抗菌肽BMAPM的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7、SEQ ID NO.8中的任一所示。

一种制备所述抗菌肽BMAPM的方法，采用微生物表达获得抗菌肽BMAPM；或直接采用人工合成的方式来制备抗菌肽BMAPM。

所述的制备抗菌肽BMAPM的方法，采用微生物表达获得抗菌肽BMAPM的具体方法是：以荧光蛋白为筛选标记，利用简并引物构建抗菌肽BMAPM的编码核苷酸随机突变库，进行诱导表达，通过检测荧光强度筛选荧光强度强的突变株为表达菌株，对表达菌株进行诱导表达，获得抗菌肽BMAPM。

所述的表达抗菌肽BMAPM的方法，利用简并引物通过PCR的方法随机突变抗菌肽BMAPM的N端编码核苷酸序列。

所述筛选标记是在抗菌肽C端融合荧光蛋白。