[发明专利]一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法

说明书

本发明公开了一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法，包含以下步骤：将激化剂与活化因子包被至培养瓶内得到激化活化因子；通过密度梯度离心法将人外周血液内的单个核细胞分离出；在激化活化因子包被的培养瓶中添加活化培养基，再将提取的单个核细胞按照2*106/ml的浓度接种于包被有激化活化因子的培养瓶中；观察细胞生长状态及培养基颜色变化情况，培养3‑4天将接种于装有包被激活活化因子的细胞转移至空白培养瓶中添加扩增培养基A继续培养；培养至5‑6天添加扩增培养基B继续培养；培养至7‑8天将所得的细胞转移至培养袋中添加扩增培养基C继续培养，每间隔2‑3天添加扩增培养基C；待培养至15‑16天后得到NK免疫细胞。

技术领域

本发明涉及细胞扩增技术领域，具体涉及一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法。

背景技术

目前，恶性肿瘤已经成为中国人的头号杀手，中国卫生部2008年发布的第三次全国死因调查显示，中国城乡居民的癌症死亡率在过去30年中增长了80％以上，每4位死亡人数中就有1位死于癌症，中国每年新增肿瘤患者200万，因患肿瘤死亡的人数超过150万，2000年,美国“国际肿瘤生物/免疫治疗及基因治疗”年会总结报告中指出：“生物治疗是目前知道的唯一一种有望完全消灭癌细胞的治疗手段，21世纪是肿瘤生物治疗的时代”，以常规治疗(手术、放疗、化疗)辅以肿瘤生物/免疫治疗的综合疗法，将成为人类征服癌症的主要途径；

为了提高恶性肿瘤患者的生存率，最具有挑战性的工作是如何在临床上使用合适的综合治疗方案，扩大获益患者人群，维持治疗效果，控制肿瘤的进展速度，免疫细胞治疗作为肿瘤的辅助治疗已经越来越多的参与到临床综合治疗中，自然杀伤(naturalkillercell，NK)细胞是先天性免疫系统的重要组成部分，是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞，NK细胞无需肿瘤特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞，NK细胞治疗具备广谱性，作为肿瘤综合治疗中的一个新方法，通常与化疗、放疗和手术治疗结合使用，在多种肿瘤的治疗中展示了应用前景；

多年来，国内外大量研究者一直尝试在体外实现NK免疫细胞亚群的大量扩增，但是目前市场上常规技术主要是通过在体外培养体系中添加IL-2、IL-12、IL-15和γ-IFN等因子的组合来激活、扩增NK免疫细胞，因此经过14天的培养后仅可以是NK细胞体外增殖几倍或者几十倍，同时NK细胞的纯度亦不理想，数量上无法达到临床治疗级别所需的量，纯度不高，在临床上亦达不到应有的效果；

由于白介素类细胞因子均不是强力的NK细胞活化剂，缺乏强有力的活化作用，当NK细胞被充分活化后，白介素类细胞因子对NK细胞的活性维持和增殖发挥了极为重要的作用，因此，获得高数量高纯度的NK细胞，首先需要充分活化NK细胞，与此同时，目前的常规制备方法，针对于细胞因子需求量比较大，成本较高，培养制备效果不稳定，不适合体外大规模的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有技术需要获取高数量高纯度的NK细胞，但是细胞因子需求量比较大，成本较高，培养制备效果不稳定，不适合体外大规模的应用，本发明提供一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法，能够解决现有技术中体外扩增NK细胞数量少，抗癌作用能力低，扩增倍数少，纯度不理想的问题，用以解决现有技术导致的缺陷。

为解决上述技术问题本发明提供以下的技术方案：

一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法，其中，包含以下步骤：

步骤1：将激化剂与活化因子包被至培养瓶内，保持4度的温度静置，得到激化活化因子；

步骤2：通过密度梯度离心法将人外周血液内的单个核细胞(PBMC，是英文peripheral blood mononuclear cell的缩写，中文名叫外周血单个核细胞，是指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞等)分离出；