[发明专利]一种特异性识别T-2毒素的适配体亲和柱及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种特异性识别T‑2毒素的适配体亲和柱及其制备方法和应用。本发明制备的适配体亲和柱是将T‑2毒素适配体通过化学键偶联在载体上得到偶联胶体，将偶联胶体重悬后装柱得到。本申请所制备的适配体亲和柱可用于富集和纯化粮食、坚果、饲料、乳及乳制品、水产、中药、体液及水中的T‑2毒素。

技术领域

本发明涉及食品安全生物技术领域，特别涉及一种特异性识别T-2毒素的适配体亲和柱及其制备方法和应用。

背景技术

T-2毒素(T-2toxin)是主要由三线镰刀菌、枝孢镰刀菌和梨孢镰刀菌筝镰刀菌属产生的有毒次级代谢产物，是类单端孢霉烯族真菌毒素中毒性最强的一种。T-2毒素是一种四环的倍半萜烯化合物，化学名4β-15-乙酰氧基-3α-羟基-8α-(3-甲基丁酰氧)-12，13-环氧单端孢霉-9-烯，分子式为C24H34O9，相对分子质量为466.2。T-2毒素广泛分布于自然界，主要污染玉米、燕麦、小麦、大麦、稻米等谷物产品。T-2毒素是非挥发性的，室温放置6～7年或在100～120℃下加热1h，其毒性依然不减。因此，T-2毒素对人畜健康的危害尤其严重，其毒性作用主要包括急性毒性作用、亚急性毒性、慢性毒性、三致作用、免疫毒性以及对血液系统和软组织的损害。

目前，实际样品中的T-2毒素检测与精准分析多需要借助大型仪器，而为了保证结果的准确，也为了保护仪器延长其使用寿命，需要进行样品前处理，且对前处理要求较高。通常情况下，样品前处理需要通过免疫亲和柱等净化步骤进行毒素的分离与提纯，去除样品中的固体杂质与其他干扰离子。免疫亲和柱(Immunoaffinity column，IAC)以抗体为作用主体，特异性结合样品中真菌毒素。因其高特异性、高灵敏度及净化效果好等优势，是目前使用最多、富集效能较强的真菌毒素样品前处理技术。目前，国内外多采用溴化氰活化的琼脂糖凝胶为载体，以随机偶联的方式将抗体分子固定在层析介质上制备亲和柱。然而由于抗体分子属于蛋白质类物质，对使用环境要求敏感。因此在实际检测过程中，若样品成分复杂则会干扰抗体的效能，从而降低免疫亲和柱的富集纯化效能。为了克服传统免疫亲和柱中存在的问题，以适配体为抗体代替物的适配体亲和柱愈益受到关注。

核酸适配体(Aptamer)是从体外合成的随机寡核苷酸文库中通过指数富集配体的系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)技术筛选得到的与靶物质特异性结合的小分子DNA或RNA片段。核酸适配体能够识别与之对应的任何类型的蛋白和低分子等靶物质，并与靶物质具有高度亲和力。与抗体相比较，核酸适配体有诸多优点，比如体外合成周期短、制备成本低、无需动物实验、稳定性好、对温度不敏感和易于修饰等等。

本发明获得的T-2毒素适配体亲和柱可用于富集纯化复杂食品样品中的T-2毒素，有助于提高后续检测方法的准确度和灵敏度。克服了传统免疫亲和柱对使用环境要求敏感的缺点，具有良好的稳定性。对于被T-2毒素污染的普通食品、饲料以及珍贵药材等，可通过适配体亲和柱净化分离实现去污染的目的，使污染品恢复其使用价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种特异性识别T-2毒素的适配体亲和柱及其制备方法和应用。本发明制备的适配体亲和柱采用链霉亲和素琼脂糖凝胶作为载体，可负载大量适配体从而具有极高柱容量，具有稳定性好、成本低、保质期长和易于修饰等优点。

本发明的技术方案如下：

一种特异性识别T-2毒素的适配体，所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

T-2毒素适配体的核苷酸序列：

5'-biotin-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGAAGTCGTGCATCTG-3'。