[发明专利]诱导MSC细胞向软骨方向分化的仿生材料、制备方法及应用

说明书

本发明公开了诱导MSC细胞向软骨方向分化的仿生材料、制备方法及应用，以PLGA微球为核，PLGA微球表面包覆有软骨细胞膜；PLGA微球以含有软骨细胞分泌因子的条件培养基为内水相、PLGA溶液为油相、聚乙烯醇水溶液为外水相形成的水/油/水微球；含有软骨细胞分泌因子的条件培养基为软骨细胞培养中培养得到的上清液重组浓缩得到；本发明得到的仿生材料，能够实现外泌体和生长因子等在与MSC培养时进行可控释放，以此达到促进MSC成软骨分化；软骨细胞膜，提高了PLGA微球的生物相容性，能够与MSC更好的结合，增强其与细胞之间的信号交流，促进MSC向软骨方向分化。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及诱导MSC细胞向软骨方向分化的仿生材料、制备方法及应用。

背景技术

由于软骨细胞密度低，缺乏血管及神经，因此软骨的再生能力较低，创伤或疾病引起的局灶性或退行性病变可最终导致骨关节炎。目前热门方向是用组织工程学包括结合支架材料、细胞和生物活性因子在体外进行组织再生。即利用细胞在体外培养出组织后再移植到体内进行修复。其中一个研究方向便是利用软骨细胞与MSC(间充质干细胞)在体外共培养(两种细胞一起混合培养)，来促进MSC向软骨细胞分化。但体外培养用到的软骨细胞需要二次手术的提取，且提取的数目有限，同时细胞对于运输和存储的条件也较为苛刻，这样不仅会造成较高的技术门槛，同时也使得手术风险加大，不可控的因素增多。

发明目的

本发明针对现有技术存在的问题提供一种与MSC共培养时协同互利作用，诱导MSC向软骨方向分化的仿生材料、制备方法及应用。

本发明采用的技术方案是：诱导MSC细胞向软骨方向分化的仿生材料，以PLGA微球为核，PLGA微球表面包覆有软骨细胞膜；PLGA微球以含有软骨细胞分泌因子的条件培养基为内水相、PLGA溶液为油相、聚乙烯醇水溶液为外水相形成的水/油/水微球；软骨细胞条件培养基为软骨细胞培养基培养得到的上清液重组浓缩得到。

仿生材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：提取软骨细胞，然后培养至P2～P5代；

步骤2：采用步骤1得到的软骨细胞提取软骨细胞膜；

步骤3：将步骤1得到的软骨细胞在DMEM高糖培养基中培养，收集上清液，冻干后利用DMEM高糖培养基重新溶解浓缩得到含有软骨细胞分泌因子的条件培养基；

步骤4：以含有软骨细胞分泌因子的条件培养基为内水相、PLGA溶液为油相、聚乙烯醇水溶液为外水相形成水/油/水的PLGA微球；

步骤5：将步骤2得到的软骨细胞膜和步骤4得到的PLGA微球混合、超声、离心洗涤后，即可得到所需仿生材料。

进一步的，所述步骤2中提取软骨细胞膜的过程如下：

将步骤1得到的软骨细胞用胰蛋白酶消化后，经过三次反复冻融循环，依次用质量浓度为15wt.％、30wt.％的蔗糖溶液离心，去除生物大分子及细胞核即可得到所需软骨细胞膜。

进一步的，所述步骤4中PLGA微球制备方法如下：

S11：将质量浓度为40～100g/L的PLGA溶液和含有软骨细胞分泌因子的条件培养基按照一定的比例混合，超声得到初级乳液；

S12：将步骤S11得到的初级乳液与质量浓度为1wt％的聚乙烯醇水溶液按照质量比为1:5～1:10的比例混合，乳化后形成二次乳液；

S13：将步骤S12得到的二次乳液除去溶剂，得到微球溶液；将微球溶液离心得到初始微球，初始微球固化后即可得到所需PLGA微球。

进一步的，所述步骤3中的冻干后得到的冻干粉与DMEM高糖培养基按照一定的质量比例进行溶解浓缩。