[发明专利]一种GS基因敲除CHO-K1细胞株的构建方法及悬浮细胞单克隆化

说明书

本发明公开了一种GS基因敲除的CHO‑K1细胞株的构建方法，包括贴壁培养CHO‑K1细胞，设计并选择sgRNA，将选择的sgRNA与EGFP mRNA、Cas9mRNA组成转染混合物对CHO‑K1共转染，得到GS基因敲除的CHO‑K1细胞株。本发明使用RNA转染混合物对CHO‑K1细胞进行共转染，是一种基于RNA的GS敲除方法，同时结合CRISPR/Cas9基因编辑手段以及结合GFP筛选，既避免了DNA层面的基因组重整，降低了基因组被污染的风险，又提高了GS基因敲除效率，还降低了细胞筛选的工作量；对本发明得到的GS基因敲除的CHO‑K1细胞株进行验证，表明，GS基因敲除效率符合预期。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种GS基因敲除CHO-K1细胞株的构建方法及悬浮细胞单克隆化。

背景技术

中国仓鼠卵细胞(CHO细胞)已成为生产治疗性重组蛋白的最广泛使用的宿主细胞之一。可以快速识别大量低产和非生产性细胞中的那些稀有高产细胞系,达成有效和高效的临床细胞系开发过程，对于加速生物药物开发具有重大意义。

两种最常见的用于重组蛋白生产的CHO表达系统利用基于二氢叶酸还原酶(DHFR)的甲氨蝶呤(MTX)的选择方法或基于谷氨酰胺合成酶(GS)的甲硫基亚甲氧嘧啶(MSX)的选择方法。其中，基于CHO-K1细胞系的GS基因敲除细胞系是目前广泛使用的表达系统。其筛选的原理如下：GS基因敲除的CHO-K1细胞自身无L-谷氨酰胺合成酶的功能，必须严格依赖于外源提供的L-谷氨酰胺才能存活，将GS基因敲除的CHO-K1细胞经转染后，置于无L-谷氨酰胺的培养基中，只有整合入外源GS基因且整合位点在基因组内转录活跃区域的细胞才能存活下来，而目目标蛋白基因位于GS基因的上游或者下游，因此，可以筛选到GS和蛋白表达量较高的细胞株。

因此，如何获得GS基因敲除的CHO-K1细胞株成为本领域内的重要研究课题。虽然，通过同源重组的常规基因敲除已用于基础研究和工业细胞系的生产中，但是，同源重组的常规基因敲除耗时耗力且效率低下，不利于CHO细胞工程的发展；目前，更为常用的方法为通过CRISPR/Cas基因编辑技术进行GS基因敲除，但是，该方法一般在DNA层面进行，不可避免基因组重整，基因组有一定的被污染风险，同时，GS基因敲除效率有待提高；GS基因敲除的CHO-K1细胞筛选时需要使用化合物且工作量较大。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种GS基因敲除的CHO-K1细胞株的构建方法，避免GS基因敲除过程中DNA层面的基因组重整，且提高GS基因敲除效率，减少GS基因敲除的CHO-K1细胞筛选的工作量。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种GS基因敲除的CHO-K1细胞株的构建方法，包括如下步骤：

步骤A：基于CHO-K1细胞GS外显子-5的核苷酸序列，设计并选择sgRNA-GS57用于对GS基因的敲除；

外显子-5的核苷酸序列如SQE ID NO.1所示；

sgRNA-GS57的核苷酸序列如SQE ID NO.2所示。

步骤B：将sgRNA-GS57与EGFP mRNA、Cas9 mRNA组成转染混合物，对CHO-K1细胞进行共转染，使用FACS分选出共转染的CHO-K1细胞，再将共转染的CHO-K1细胞进行单细胞分选，接种单个共转染的CHO-K1细胞，静置培养，得到单克隆的GS基因敲除CHO-K1细胞株。

优选地，所述方法还包括如下步骤：

步骤C：检验步骤F得到的GS基因敲除的CHO-K1单克隆细胞株的GS表达；

步骤D：对步骤F得到的GS基因敲除的CHO-K1单克隆细胞株进行二代测序，检验GS基因敲除效果。