[发明专利]一种GS基因敲除CHO-K1细胞株的构建方法及悬浮细胞单克隆化

权利要求书

1.一种GS基因敲除的CHO-K1细胞株的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤A：基于CHO-K1细胞GS外显子-5的核苷酸序列，设计并选择sgRNA-GS57用于对GS基因的敲除；

外显子-5的核苷酸序列如SQE ID NO.1所示；

sgRNA-GS57的核苷酸序列如SQE ID NO.2所示；

步骤B：将sgRNA-GS57与EGFP mRNA、Cas9 mRNA组成转染混合物，对CHO-K1细胞进行共转染，使用FACS分选出共转染的CHO-K1细胞，再将共转染的CHO-K1细胞进行单细胞分选，接种单个共转染的CHO-K1细胞，静置培养，得到单克隆的GS基因敲除CHO-K1细胞株。

2.如权利要求1所述的GS基因敲除的CHO-K1细胞株的构建方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：

步骤C：检验步骤F得到的GS基因敲除的CHO-K1单克隆细胞株的GS表达；

步骤D：对步骤F得到的GS基因敲除的CHO-K1单克隆细胞株进行二代测序，检验GS基因敲除效果。

3.如权利要求1所述的GS基因敲除的CHO-K1细胞株的构建方法，其特征在于，步骤B中，所述转染混合物的EGFP mRNA与Cas9 mRMA的摩尔量比满足如下关系：EGFP mRNA∶Cas9mRMA＝1∶10。

4.如权利要求3所述的GS基因敲除的CHO-K1细胞株的构建方法，其特征在于，所述转染混合物使用的培养基为减血清培养基，所述转让混合物还包括转染试剂。

5.如权利要求1所述的GS基因敲除的CHO-K1细胞株的构建方法，其特征在于，步骤B中，待转染的CHO-K1细胞经贴壁培养得到，所使用的培养基为含10％胎牛血清的F12K培养基。

6.如权利要求1所述的GS基因敲除的CHO-K1细胞株的构建方法，其特征在于，步骤B中，转染时间为三天，其中，使用含10％胎牛血清的F12K培养基培养一天，之后更换培养基培养两天，更换后的培养基为含10％胎牛血清和4mM L-谷氨酰胺的F12K培养基。

7.如权利要求1所述的GS基因敲除的CHO-K1细胞株的构建方法，其特征在于，步骤B中，FACS分选出的共转染CHO-K1细胞为GFP阳性的共转染CHO-K1细胞。

8.如权利要求7所述的GS基因敲除的CHO-K1细胞株的构建方法，其特征在于，将GFP阳性的共转染CHO-K1细胞进行单细胞分选后，培养单克隆细胞株的具体步骤如下：

步骤B1：对GFP阳性的共转染CHO-K1细胞进行单细胞分选后，接种至96孔板，并对96孔板进行细胞成像，选出由单细胞长成的克隆细胞，并进行培养；

步骤B2：当由单细胞长成的克隆细胞长至40％-50％汇合度时，扩培至24孔板，再长至70％-80％汇合度时，即可进行细胞冻存。

9.如权利要求8所述的GS基因敲除的CHO-K1细胞株的构建方法，其特征在于，

步骤B1中，96孔板所使用的培养基为含10％胎牛血清的F12K培养基，所述培养基中还包括1％含量的青链霉素溶液；

步骤B2中，24孔板所使用的培养基为含10％胎牛血清的F12K培养基。

10.如权利要求2所述的GS基因敲除的CHO-K1细胞株的构建方法，其特征在于，检验GS基因敲除的CHO-K1单克隆细胞株的GS表达的步骤如下：

步骤C1：使用细胞裂解液对GS基因敲除的CHO-K1单克隆细胞株进行细胞裂解，再将细胞裂解物进行冻融处理，之后将冻融处理的细胞裂解物与上样缓冲液混合并煮沸处理后待用；

步骤C2：采用蛋白质印迹法对步骤F1得到的产物进行GS表达分析。