[发明专利]一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法

说明书

本发明涉及一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法，属于基因工程与酶工程技术领域。联合利用GDP‑L‑岩藻糖合成相关酶和L‑岩藻糖基转移酶，催化底物GDP‑L‑岩藻糖和乳糖反应，合成岩藻糖基化乳糖。GDP‑L‑岩藻糖合成相关酶和岩藻糖基转移酶双酶偶联反应2‑12小时可获得200‑500mg/L岩藻糖基乳糖；进一步偶联能再生ATP和GTP的PPK酶进行反应，不仅能降低昂贵底物ATP和GTP的用量，减少生产成本，而且反应转化率大幅度提高，反应同样时间，岩藻糖基乳糖产量可提高至500‑700mg/L。本发明与化学法和发酵法相比，生产工艺安全，并且反应耗时较短。本发明提供了一种能高效、低成本、体外制备2’‑FL和3‑FL的新方法。

技术领域

本发明属于基因工程与酶工程技术领域，尤其是涉及一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法。

背景技术

母乳是一种可以为婴儿肠道和免疫系统的生长和发育提供生物活性的复杂的生物流体，作为母乳中第三丰富的固体组分，人乳寡糖(HMOs)在婴儿发育中发挥重要作用，其可作为可溶性诱饵受体，防止病原体附着在婴儿粘膜表面，降低病毒、细菌和原生动物寄生虫感染的风险。此外，人乳寡糖还可以调节上皮细胞和免疫细胞的反应，减少过度的粘膜白细胞浸润和活化，降低坏死性小肠结肠炎的风险。

人乳寡糖种类繁多，除直接提取外，还可通过化学法、发酵法和酶法获得，目前工业制备以化学法和发酵法为主，酶法尚处于实验室研究阶段。但鉴于化学合成步骤复杂、反应条件苛刻、需要大量有机试剂，发酵法周期长、复杂培养基组分使得产物纯化困难、现用重组宿主多为非食品安全性的大肠杆菌等问题，人们倾向于开发条件温和可控、耗时短、反应体系成分简单的酶法。

岩藻糖基化乳糖在人乳寡糖中占比最大，可由岩藻糖基转移酶催化底物GDP-L-岩藻糖和乳糖反应获得。根据GDP-L-岩藻糖产生的方式，分为从头合成途径和补救途径两种。从头途径中葡萄糖经过磷酸甘露糖变位酶转化为甘露糖-1-P，再经GDP-甘露糖焦磷酸化酶和GTP的作用下转化为GDP-甘露糖，GDP-甘露糖经过GDP-甘露糖4,6-脱水酶和GDP-岩藻糖合成酶即可合成GDP-L岩藻糖；补救途径中L-岩藻糖先经岩藻糖激酶和ATP转化为岩藻糖-1-P，接着在GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶作用下与GTP反应生成GDP-L-岩藻糖，最后GDP-L-岩藻糖和乳糖在岩藻糖基转移酶作用下合成岩藻糖基乳糖。不论从头途径还是补救途径制备岩藻糖基化乳糖，均需要足够的ATP和(或)GTP供给。

近年来有关岩藻糖基乳糖制备的专利与文献不断涌现。丹麦GlycomA/S公司采用化学法合成了公斤级2’-FL，但得率仅为19.8％-27.3％。专利CN202010084247改造高产可拉酸的大肠杆菌，获得的菌株E.coli S17-3能以乳糖为唯一底物发酵96h以上产生0.617g/L 2’-岩藻糖基乳糖。Wen Li等将GDP-L岩藻糖从头合成途径和补救合成途径引入大肠杆菌BL21(DE3)，同时为了使底物乳糖和岩藻糖达到最大利用率并降低GDP-L-岩藻糖的代谢量，采用CRISPR/Cas9技术对LacZ、FucI、FucK和WcaJ基因进行敲除，用该宿主菌在3L发酵罐中高密度发酵80h可得到14.1g/L 2’-FL。Yun Hee Choi等通过向大肠杆菌BL21(DE3)中引入外源基因促进GTP的合成以增加GDP-L-岩藻糖的浓度，最终使用LacZΔM15突变体进行摇瓶发酵得到4.6g/L 3-FL，时空转化率为0.076g/L/h。2020年Chao Li等首次报道了体外多酶级联催化制备2’-FL的方法，时空转化率为0.73g/L/h，但ATP再生所选取的底物磷酸烯醇式丙酮酸非常昂贵，不适合工业应用。目前尚未见GTP再生系统偶联用于人乳寡糖酶法合成的报道。

发明内容

针对岩藻糖基化乳糖酶法制备中需要大量昂贵底物ATP/GTP的问题，本发明提供体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法。