[发明专利]牛筋草EPSPS蛋白胶体金检测试纸及其应用

说明书

本发明提供一种牛筋草EPSPS蛋白胶体金检测试纸及其应用。所述检测试纸由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组成；样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在背板上；金标垫上包被有胶体金标记的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，所述质控线包被有抗鼠IgG二抗。利用本发明的检测试纸可实现现场对牛筋草叶片、茎和种子等样品中EPSPS蛋白的快速、灵敏检测。

技术领域

本发明涉及蛋白检测技术领域，具体地说，涉及一种牛筋草EPSPS蛋白胶体金检测试纸及其应用。

背景技术

草甘磷是一种非选择性的广谱除草剂，具有高效、低毒、无残留等优点，尤其是对人畜毒害小，是全球应用最广的除草剂之一。草甘膦的靶标是5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，EPSPS是生物体内芳香族氨基酸—色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的关键酶；草甘磷是通过抑制EPSPS的活性而阻断芳香族氨基酸的合成最终导致受试植物死亡。但是作为一种非选择性除草剂，草甘膦对农作物同样具有灭生性作用，这限制了草甘膦在农业生产中的应用。美国孟山都公司通过向植物中转入具草甘膦抗性的CP4-EPSPS等基因，成功培育出了商业化的转基因抗草甘膦作物，为草甘膦的应用开辟了新途径。目前已经获得了大豆、玉米、棉花、油菜、烟草、甜菜、花生、小麦、水稻或向日葵等抗草甘膦转基因作物。

草甘膦的长期使用，引起杂草对草甘膦产生抗性，导致转基因作物减产。杂草对草甘膦的靶标抗性机制分为靶标突变和靶标酶过量表达两种。目前，抗性的分子检测方法主要有：(1)EPSPS序列保守位点PCR检测；(2)EPSPS基因表达量qPCR检测；(3)EPSPS蛋白免疫印迹检测等，其中PCR与qPCR的方法对场地、仪器、技术人员的要求比较高，样本处理复杂，成本较高。蛋白免疫印迹检测方利用免疫学原理对目的蛋白进行定性定量鉴定，利用靶标蛋白抗体可以通过Western blot和ELISA方法进行定性定量分析，检测植株中目的蛋白在不同组织器官和不同环境条件下的表达水平。

胶体金试纸法将特异的抗体交联到试纸条上，利用胶体金试纸条技术制备的单克隆抗体试纸条，可以对牛筋草植株进行快速的检测鉴定，该方法对场地、仪器、技术人员的要求相对较低，检测时间短。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛筋草EPSPS蛋白胶体金检测试纸及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种牛筋草EPSPS蛋白胶体金检测试纸(牛筋草EPSPS蛋白手持式胶体金速测试纸)，所述检测试纸由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组成；样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫(吸收垫)依次相互叠加粘贴在背板上，各部分之间相互叠加2-3mm；金标垫上包被有胶体金标记的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线(T线和C线)，所述检测线包被有抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，所述质控线包被有抗鼠IgG二抗；

其中，所述抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体(鼠抗EPSPS单克隆抗体)由保藏编号为CGMCC No.22308的杂交瘤细胞株FL-374-08分泌产生。该杂交瘤细胞株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2021年4月14日。

抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的获得方法如下：将编码牛筋草EPSPS蛋白(SEQID NO:1)的基因经过优化重组构建到大肠杆菌表达系统中，表达纯化得到重组EPSPS蛋白；用该重组EPSPS蛋白免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，再用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选获得特异性单克隆抗体细胞株，通过制备腹水的方式，经过纯化获得特异性单克隆抗体。该单克隆抗体对EPSPS蛋白特异性强、灵敏度高，效价高，可特异性对牛筋草不同器官中的EPSPS蛋白进行精准检测。