[发明专利]一种测定γ-谷氨酰转肽酶探针及其合成方法和应用

说明书

本发明公开了一种测定γ‑谷氨酰转肽酶的荧光探针，结构式为：该荧光探针在γ‑谷氨酰转肽酶的作用下，能够实现荧光信号从弱到强的转变，进而检测γ‑谷氨酰转肽酶的活性。该探针具有良好的水溶性，其水溶液中存在微弱的荧光现象，加入γ‑谷氨酰转肽酶后，酶催化反应可将探针中的肽键切断，探针中荧光基团的荧光恢复，进而发出黄绿色的荧光。根据这种现象开发此探针，本发明不仅可以通过肉眼进行可视化的检测，还具有选择性好、分析检测便捷等优点。

技术领域

本发明属于酶活性检测技术领域，涉及一种用于检测细胞内源性γ-谷氨酰转肽酶的方法策略。更具体地说是涉及一种荧光探针及其合成方法和它在检测γ-谷氨酰转肽酶中的应用。

背景技术

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase),简称γ-GT、GGT，是γ-谷氨酰基循环中催化氨基酸的吸收或向组织细胞内转移的连续酶促反应中的一种关键酶。其作用是催化谷胱甘肽与某种途径主动吸收的氨基酸进行转肽，生成γ-谷氨酰氨基酸和半胱氨酰甘氨酸。广泛存在于人体组织的上皮细胞内，正常人血清中含量很少，主要来自肝脏。血清γ-GT与AFP均有癌胚特性。

已经证明，γ-谷氨酰转肽酶在一些人类疾病中存在过度表达的现象，例如肝癌，乳腺癌，卵巢癌和宫颈癌。因此γ-谷氨酰转肽酶可以认为是诊断癌症的重要的生物标志以及癌症治疗中的生物靶标。

因此，如何建立一种具有出色灵敏度和选择性的可靠的测定γ-谷氨酰转肽酶探针及其合成方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种测定γ-谷氨酰转肽酶的荧光探针。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种测定γ-谷氨酰转肽酶的荧光探针，其结构式为：

所述荧光探针将特定的反应位点谷氨酰基引入非发射骨架上，以产生GGT-靶标受体，从而极大地减弱了原荧光基团中的固有荧光。引入GGT后，可以除去谷氨酰基，生成荧光产物继而反映GGT的活性。可以通过荧光检测设备进行可视化鉴别，也可进入活细胞中对细胞内源性γ-谷氨酰转肽酶进行测定。

本发明的另一个目的在于提供上述的一种测定γ-谷氨酰转肽酶的荧光探针的合成方法，具体包括如下步骤：

(1)将氨基苯酚、叔丁基二甲基氯硅烷和咪唑依次加入到溶剂中，在室温下经搅拌至反应完毕、然后经后处理得产物A；

(2)将Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯、1-羟基苯并三唑和1-乙基-碳酰二亚胺盐加入到溶剂中，在0-5℃下搅拌0.5-2h，然后加入三乙胺和产物A溶液，升温至室温，继续搅拌至反应完毕，再经后处理得产物B；

(3)将产物B加入到溶剂中，然后加入四丁基氟化铵，在室温下搅拌至反应完毕，再经后处理得产物C；

(4)将产物C溶于溶剂中，在0℃下搅拌0.5-1h，然后加入三乙胺和丹酰氯溶液，升温至室温继续，搅拌至反应完毕，然后经后处理得到产物D；

(5)将产物D溶于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液中，在0℃下避光搅拌0.5-2h后，升温至室温继续搅拌至反应完毕，然后经后处理得到测定γ-谷氨酰转肽酶的荧光探针NSA-GGT。

上述的荧光探针NSA-GGT的合成路线，如下所示：

优选的，步骤(1)中对氨基苯酚、叔丁基二甲基氯硅烷和咪唑的摩尔比为1：(1.2～2.5)：(1.2～2.5)。