[发明专利]通过反复染色和脱色检测细胞的方法

说明书

本发明涉及用于通过提供具有通式(I)的缀合物来检测生物样本的样品中的靶部分的方法，其特征在于a)使生物样本的样品与至少一种缀合物(I)接触，从而用缀合物(I)标记被抗原识别部分识别的靶部分；b)用波长在荧光部分FL的吸收光谱内的光来激发标记的靶部分；c)通过检测由荧光部分FL发出的荧光辐射来检测标记的靶部分，和d)通过用波长在荧光部分FL的吸收光谱内的光，将缀合物照射足以传递足够能量的时间，使标记的靶部分的荧光部分FL降解，所述能量使由荧光部分FL发出的荧光辐射至少降低了初始荧光辐射的75%。

技术领域

本发明涉及通过用具有检测部分和抗原识别部分的缀合物标记靶部分或靶细胞，从细胞样品中检测或鉴定靶部分或靶细胞的方法，其中在检测靶部分后，检测部分通过用光照射而降解，且从而使后续标记和检测成为可能。

背景技术

与一种或多种抗体缀合的荧光部分通常用于免疫荧光分析。在过去的二十年中，在抗体、荧光部分、流式细胞仪、流式分选仪和荧光显微镜方面已开发了大量变型，以使靶细胞的特异性检测和分离成为可能。

利用荧光部分用于靶细胞的分离供体检测是已知的，所述荧光部分可以在检测后被去除或破坏。例如，US7776562公开了基于用可逆肽/MHC-多聚体或Fab-streptamer间接、非共价标记靶细胞的可逆荧光标记方法。

为了降低检测后的荧光辐射，GB2372256公开了通过提供缀合物来猝灭荧光辐射的方法，所述缀合物包含经由接头与抗体附着的多个荧光部分。荧光部分的高密度将猝灭荧光信号。此外，GB2372256描述了酶促降解接头，以便从缀合物释放荧光部分。释放的荧光部分不经受自猝灭，导致更强烈的荧光信号，即更好的分辨率。

荧光信号的消除对于基于序贯染色样本的免疫荧光技术是必需的。与同时使用标记和检测的标准程序相比，这些技术已显示提供了更高的多路复用潜力。然而，这些技术基于抗体缀合的荧光部分通过化学漂白程序的氧化破坏(US7741045B2、EP0810428B1或DE10143757)，或者在基于光漂白的方法的情况下，漂白的速率比此处呈现的方法更慢。US2019/0162721A1显示了在分支的PEG上多聚化后，通过光增加的染料漂白。

与小分子染料附着的缀合聚合物(CP)也用于信号放大，并且如US10126302B2或US10481161B2中用作亮荧光部分。但是，没有提到增强的光漂白。

现有技术的主要意图是提供染料或包含此类染料的缀合物，其发出尽可能强烈的荧光辐射，即具有最大的量子产率。为了提供可靠和可再现的信号，将染料设计为尽可能稳定。尽管这些性质对于细胞检测和细胞分离如FACS方法是有利的，但它们阻止细胞被反复染色且检测。

发明内容

相应地，需要建立用于由亮荧光部分标记的靶部分的染色和脱色的方法，其中所述染色过程提供了尽可能明亮的信号，所述信号可以在脱色过程中尽可能快速地完全去除。发现了在适当选择某些缀合物和定制方法开发后，能够实现非常有效的染色/脱色过程。

本发明的目的是用于通过提供具有通式(I)的缀合物来检测生物样本的样品中的靶部分的方法，

其中Ar、MU和L1作为聚合物的重复单元，

Ar是芳基或杂芳基，

MU是沿着聚合物主链均匀或随机分布的聚合物修饰单元或带隙修饰单元，

L1是沿着聚合物均匀或随机分布的芳基或杂芳基，

L2是定位于聚合物的端部上的芳基或杂芳基，

FL是荧光部分，

G1和G2代表氢、卤素或抗原识别部分，条件是G1或G2中的至少一个是抗原识别部分，

和

a是10至100摩尔%，

b是0.1至50摩尔%，

c是0至90摩尔%，

d是1至10,000，