[发明专利]一种分离富集循环肿瘤细胞的多肽功能化微纳界面材料及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种分离富集循环肿瘤细胞的多肽功能化微纳界面材料及其制备方法和应用。所述多肽功能化微纳界面材料包括肿瘤特异性靶向多肽、纳米纤维、连接多肽与纳米纤维的二硫键。该多肽功能化微纳界面材料能够实现肿瘤细胞的高效捕获(90％)，可以同时分离捕获得到EpCAM阳性和EpCAM阴性的CTCs，实现了肝癌患者及治疗过程中体内CTCs及其变化的检测，在早期诊断、转移预测和预后方面具有应用前景。

技术领域

本发明属于生物材料和临床检测技术领域，具体涉及一种分离富集循环肿瘤细胞的多肽功能化微纳界面材料及其制备方法和应用。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是存在于血液系统中、源自于原发性肿瘤的癌细胞，和肿瘤转移、复发等密切相关，是癌症研究的重要标志物。作为液体活检的新型手段，CTCs的检测在指导治疗进程，预测疾病发展和评估生存率等方面发挥了重要作用。此外，CTCs的分离和后续的分子谱分析可为个性化治疗和理解转移的生物学机制提供重要信息。然而，CTCs在血液中的含量极其之少，10⁹个血细胞中仅存在几个至几十个CTCs，为CTCs的分离和检测带来了巨大的挑战。

迄今为止，基于癌细胞的物理特性和生化特性，已发展了诸多用以识别CTCs的技术。一些纳米材料和设备可以区分CTCs和血细胞之间的大小或表面粗糙度，已广泛应用于CTCs的捕获与分离。为了在分子水平上靶向CTCs，抗体，适配体，多肽等也被用作CTCs的捕获元件。上皮细胞标志物，如上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)是CTC分析中最常见的靶标蛋白。目前，将尺寸选择和分子识别相结合的策略的发展大大提高了CTCs分离的灵敏度和选择性。然而，CTCs存在异质性，并且在上皮间质转移(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程中易丢失一些通用的靶标蛋白，限制了实际样本中CTCs检测的准确性。对于具有高转移潜能的肿瘤细胞，上皮标志物(如：EpCAM)的表达会下调，从而使得这些CTC亚群无法通过基于上皮标志物的方法检测出来。此外，肝癌细胞和软组织癌细胞等上皮标志物的表达量也很低，因此难以适用于通用的CTC分离方法。举例来说，超过80％的肝癌患者EpCAM阴性，从而难以通过基于EpCAM的方法来分离CTCs。与此同时，在分离的过程中保持CTCs的生物学活性对后续的分子谱分析至关重要。因此，发展一种新型的CTCs分离富集材料和方法，获取不同亚型的循环肿瘤细胞，对于肿瘤的早期筛查、精准治疗和分子机制研究十分关键。

发明内容

为解决现有技术中存在主要捕获EpCAM阳性的CTCs而易丢失EpCAM阴性的CTCs，导致检测结果不准确的问题，本发明提供了一种多肽功能化的、具有微纳表面形貌的材料，可实现血液样品中不同亚型循环肿瘤细胞的高效捕获和分离富集。

本发明第一方面提供了一种分离富集循环肿瘤细胞的多肽功能化微纳界面材料，其包括三个组成部分：

A)肿瘤特异性靶向多肽；B)纳米纤维；C)连接多肽与纳米纤维的二硫键；

优选地，所述肿瘤特异性靶向多肽以所述肿瘤细胞表面携带的标志蛋白溶酶体相关四次穿膜蛋白(lysosome-associated protein transmembrane 4 beta，LAPTM4B)作为特异性靶标；具体地，所述肿瘤特异性靶向多肽为AP2H多肽，其氨基酸序列如下所示：IHGHHIISVG(SEQ ID NO:1)。

优选地，所述纳米纤维为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(D,L-lactide-co-glycolide)，PLGA)纳米纤维(分子量为38000-54000)；具体地，所述纳米纤维由静电纺丝法制备而成。

进一步的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(D,L-lactide-co-glycolide)，PLGA)纳米纤维的纤维直径优选为100-1500nm。