[发明专利]一种可分化再生的延缓机体衰老的干细胞培养方法

说明书

本发明公开了一种可分化再生的延缓机体衰老的干细胞培养方法，具体步骤如下：将所取得的组织，用液清洗以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织，采用消化酶将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为实验所需密度，分装于培养瓶中，单核细胞重悬于基础培养基中；PBS清洗3次去除未贴壁细胞；剩余贴壁的单核细胞继续培养，有益效果：本发明的干细胞培养基成分明确、配方简单、成本较低，可以有效的维持间充质干细胞在体外长期传代扩增后的自我更新能力和多向分化能力，延缓体外传代所致的细胞衰老。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体来说，涉及一种可分化再生的延缓机体衰老的干细胞培养方法。

背景技术

诸多研究表明干细胞不仅可以自我更新，在条件合适的情况下能分化成其他功能细胞，因此干细胞有望成为治疗人类疑难疾病的有效手段。然而，干细胞在正常成体组织中含量甚微，在体外如何快速扩增与培养干细胞培养是研究干细胞的作用机制及探索其在治疗人类疾病治疗方法的重要技术。

干细胞尽量含量甚微，但广泛分布于哺乳动物的各个组织器官，这些组织或器官包括但不局限于骨髓、脐带、脂肪组织、脑组织、视网膜、心脏、肝脏、肺以及皮肤等。大量研究表明，这些低含量的干细胞可在体外通过适当的方法进行进一步扩增，最常规的一种培养干细胞的培养基就是添加有胎牛血清的培养基。然而，采用这种培养基培养的干细胞，不仅生长比较缓慢，而且传递次数超过5代之后其分化成功能细胞的潜能大大降低，牛血清批次存在潜在的不重复性也大大影响了其规模化；另一方面，牛血清相对于人是异源性的东西，从而限制了其在临床上的应用。因此，探索快速扩增干细胞而又不影响其潜能的培养条件及其培养基组成的优化组合是非常重要的研究内容。

针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。

发明内容

针对相关技术中的问题，本发明提出一种可分化再生的延缓机体衰老的干细胞培养方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种可分化再生的延缓机体衰老的干细胞培养方法，具体步骤如下：

S1：剪切组织，先将所取得的组织，用液清洗以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织；

S2：再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mn3大小，静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次；

S3：消化分离，采用消化酶将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养；

S4：培养，细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜；

S5：将单核细胞重悬于基础培养基中，置于37℃，5％CO2孵箱培养 24小时；PBS清洗3次去除未贴壁细胞；剩余贴壁的单核细胞继续培养，每3天换液；

S6：待单核细胞增殖至75％-80％密度时，吸尽基础培养基中的培养基，传代，继续用基础培养基培养；

S7：待单核细胞培养至第五代之后，用抗衰老的干细胞培养基继续培养。

进一步的，所述液清洗采用D-Hanks或Hanks液清洗。

进一步的，所述消化酶有采用胰蛋白酶或胶原酶。

进一步的，所述基础培养基是将胎牛血清100ml、青霉素10ml、链霉素10ml依次加入880ml α-MEM培养基中，混匀后置于4℃保存。