[发明专利]一种用于外周血红细胞快速裂解的组合物及其应用

说明书

本发明提供了一种用于外周血红细胞快速裂解的组合物及其应用，该组合物包括选自以下组分中的一种或几种：葡萄糖、氯化钙、氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、DIPSO、甜菜碱、泛影酸葡甲胺、丙三醇和吐温20；其pH值为7.0～7.6。本发明采用低渗盐溶液快速耗竭红细胞，在最短时间内最大限度裂解红细胞的同时保持非红细胞活力状态，此外在离心富集白细胞时可以使得红细胞碎片远离细胞团，而达到清除细胞碎片的目的；解决了以往裂红试剂操作步骤繁琐耗时长、裂解不充分和非红细胞活力下降的问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于外周血红细胞快速裂解的组合物及其应用。

背景技术

在人体中血液是由不同类型的血细胞和其它物质组成，主要包括红细胞、白细胞、血小板、蛋白、葡萄糖、无机盐离子、激素等，其中白细胞主要组成为淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、单核细胞。现代医学诊断和分析及基础科学对于血液研究是极为广泛的，主要包括病理预测和诊断、外周血干细胞培养和移植、基于流式细胞术的血细胞分选和基于RT-PCR的细胞基因表达研究及血液微生物和病毒的检测等，此外针对白细胞的研究进而反馈出生理和病理的状况也是医学常用的方法，其主要包括免疫学相关的炎症和免疫状态的评估、白血病研究和基于循环肿瘤细胞的癌症风险评估和预测等。因此对于血液样本的处理变得极为重要，尤其是针对外周血白细胞分选和细胞培养及移植相关的医学运用和基础研究。

一般的血液样本前处理包括基于PBMC的细胞分离技术、依靠设备的血细胞分离和红细胞裂解技术，其中以红细胞裂解技术使用较为广泛。PBMC分离技术所用到的试剂用量大，价格较高，常用Ficoll-Hypaque Solution分离液，依靠进口，国产相较而言细胞回收率低且操作步骤繁琐，同时PBMC细胞分离技术所需要时间长，离心机需要配置低降速档位，对设备要求较高。依靠仪器设备的血细胞分离技术需要专门分选设备，仪器费用高，每家公司生产的设备标准不一致，较难形成统一操作，此外不宜同时进行多样本分离，易交叉污染。红细胞裂解技术主要是1979年Saas等人开发的以氯化铵水溶液为主要成分的红细胞裂解液，其余下组分为碳酸氢钾和乙二胺四乙酸二钠等，是通过破裂和耗竭红细胞而达到富集白细胞的目的。据文献报道以密度梯度离心为基础的PBMC方法和铵盐为主要成分的红细胞裂解法得到的细胞检测结果并没有明显差异，然红细胞裂解法由于操作简单省时而被广泛使用。

目前针对破碎和耗竭红细胞的裂解方法主要是依靠pH值变化、盐裂解、渗透压变化、洗涤剂和红细胞酶消化反应等。基于pH变化和低渗透压是一种剧烈反应的红细胞裂解法，其产生的结果往往多变化没有固定标准，比较难确定和控制裂红反应的终点，对白细胞伤害较大。盐裂解、洗涤剂和酶消化反应都是温和的红细胞裂解法，其缺点是步骤繁琐操作周期长，使得白细胞长时间暴露在非细胞培养环境，对细胞伤害大，此外较难清除全部红细胞，尤其是有核红细胞。

申请号为201880039682.3的专利通过高浓度盐溶液和固定剂(含甲醛溶液)来提高溶液张力使得细胞膜透化失去膨胀回缩能力并固定细胞，然后加入缓冲液(0×至10×PBS溶液)再使得红细胞因失去了膨胀回来的能力而因此破裂，其主要本质通过不同溶质盐溶液使得胞外渗透压由高变低，使得细胞由紧缩变为膨胀，从而红细胞破裂。在此过程中紧缩和膨胀对非红细胞的损伤也是极为严重的，同时透化细胞膜和固定细胞对后续培养和移植的白细胞的活力也产生极大影响，此外紧缩和膨胀对白细胞表面抗原分布产生改变，不利于进行流式细胞分选。申请号为201480060814.2的专利采用的是低浓度铵盐和HEPES及表面活性剂来裂解红细胞，在操作过程中需要长时间的孵育，据文献报道基于铵盐的红细胞裂解方法往往裂解不够充分，红细胞残留多，影响后续流式分选，同时对于细胞丰富度较少的细胞，如CD34⁺造血干细胞，损失较严重。