[发明专利]蝗虫内生真菌次级代谢产物及其提取方法和应用

权利要求书

1.蝗虫内生真菌Paraconiothyrium brasiliense来源的萜类化合物，其特征在于，所述化合物的结构如下所示：

2.权利要求1所述的蝗虫内生真菌Paraconiothyrium brasiliense来源的萜类化合物在制备抗血小板聚集的药物中的应用。

3.蝗虫内生真菌Paraconiothyrium brasiliense来源的萜类化合物在制备抗血小板聚集的药物中的应用，其特征在于，所述的萜类化合物具有如下结构式：

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，蝗虫内生真菌Paraconiothyriumbrasiliense，分类命名为Paraconiothyrium brasiliense MZ-1，Paraconiothyriumbrasiliense菌株于 2016 年 5 月 25 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学 ，保藏名称为：巴西类壳小圆孢MZ-1，保藏编号：CCTCCNO：M2016279。

5.权利要求4所述的蝗虫内生真菌Paraconiothyrium brasiliense用于发酵制备权利要求1所述的萜类化合物的用途。

6.一种发酵代谢生产萜类化合物的方法，其特征在于，包括将权利要求4所述的蝗虫内生真菌Paraconiothyrium brasiliense接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养的步骤，所述的发酵培养基为PDA固体培养基，得到种子块，种子块接入PDB培养基培养，得到种子液，将种子液接入PDB培养基培养，培养过程中添加L-色氨酸，继续发酵，得到发酵产物；

发酵产物进行分离提取：将发酵产物过滤得到菌丝体和发酵液，其中发酵液萃取、浓缩；菌丝体干燥、萃取、浓缩，合并萃取产物，再经过层析制备分离得到所述化合物，分离提取步骤为：

(1)菌丝体经干燥后采用二氯甲烷萃取、二氯甲烷浸提后得到粗体物1，发酵液采用二氯甲烷萃取、二氯甲烷浸提后得到粗体物2；将粗体物1、粗体物2混合后用正相硅胶色谱层析进行分离，采用二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇混合液进行洗脱，收集洗脱液；

(2)将洗脱液浓缩后，用甲醇溶剂溶解，再以Sephadex LH-20凝胶色谱，用二氯甲烷/甲醇的混合溶剂洗脱，每分钟流速为1毫升，每10分钟收集为一个片段；将第20个片段用色谱甲醇溶解、过滤后，利用制备型反相高效液相色谱仪进行分离，色谱柱采用C18反相柱，流动相为乙腈/水体积比为65:35的混合溶剂，在保留时间为16分钟处收集峰，即得到化合物1；将第35个片段采用色谱甲醇溶解且过滤后，利用制备型反相高效液相色谱仪进行分离，色谱柱采用C18反相柱，流动相为乙腈/水体积比为65:35的混合溶剂，在保留时间12分钟处收集峰，即得到化合物2；

所述的化合物1的结构式为化合物2的结构式为

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的L-色氨酸于培养4-5天时分三批次添加，终浓度为0.8-1 mmol/L，培养25-30天。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，二氯甲烷/甲醇混合液进行洗脱过程中，采用梯度浓度进行洗脱，所述的梯度浓度中二氯甲烷/甲醇的体积比为9:1、8:1、7:1、6:1、4:1、3:1。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，二氯甲烷/甲醇的体积比为8：1。