[发明专利]一种近红外二窗荧光免疫探针及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种近红外二窗荧光免疫探针及其制备方法与应用，荧光免疫探针为近红外荧光染料与单域抗体的偶联物，其制备方法包括以下步骤：1)将单域抗体与还原剂混合，之后振荡反应，再加入溶解在有机溶剂中的近红外荧光染料；2)将步骤1)中的混合物加入至脱盐柱，除去残余的近红外荧光染料，之后离心收集上清液即可。与现有技术相比，本发明中的荧光免疫探针的最大吸收和发射在近红外一窗(650‑900nm)区域，与抗原结合后其近红外二窗(1000‑1700nm)区域内的荧光强度大幅度增强，从而使其具有较低的光散射、较高的活体成像分辨率、较深的穿透深度及较低的用量，可应用于生物大分子的标记、跟踪和活体成像。

技术领域

本发明属于荧光成像技术领域，涉及一种近红外二窗荧光免疫探针及其制备方法与应用。

背景技术

免疫探针是指将抗体用具有特殊物理化学性质的标记物进行偶联标记，从而可对它所识别的抗原进行定性与定量检测的一种偶联物。目前，用于制备免疫探针的标记物包括放射性同位素、胶体金、荧光蛋白和有机荧光染料分子。其中，利用有机荧光染料分子制备的荧光免疫探针由于具有高灵敏度、高安全性、可实时监测等优势，被广泛用于生物大分子的标记、成像和跟踪。

然而，用于特异性靶向的生物大分子多为单克隆抗体，分子量比较大，组织或肿瘤的穿透性较弱，难以靶向具有空间位阻的靶点表位。此外，大分子量的IgG抗体必须通过哺乳动物细胞表达生产，导致成本非常高昂。为了解决这些问题，人们近年来在积极研发具有更小分子量的抗体分子片段或新结构抗体。其中，目前最有应有前景的一类抗体称为单域抗体，具体是指一类能与抗原结合的最小抗体单位，通常是指只有重链可变区的一类抗体，具备分子量小(约15kDa)、稳定性高、可溶性好、易表达及免疫原性低等特征，是一种来源简单、价格低廉、适用于批量生产的小分子抗体。单域抗体主要包括骆驼来源的纳米抗体VHH(或称为nanobody)、鲨鱼来源的VNAR以及人源的全人源纳米抗体。近期，有研究者成功筛选到一系列高亲和力全人源纳米抗体，这些抗体均具有非常高的稳定性和表达产量(CellHost Microbe 2020,27,891-898e895；Cell Host Microbe 2017,22,471-483e475.)。相较骆驼来源的单域抗体，全人源纳米抗体具有更低的人体免疫原性与更好的安全性。特别是这些小分子单域抗体在体内代谢速率快，半衰期一般在一小时内，尤其适合用于荧光免疫探针的构建，使探针同时具有高特异性、易体内代谢、低生产成本等特性。

此外，近红外二窗区域(NIR-II；1000-1700nm)的荧光信号受到的来自组织的吸收和散射较少，可以提供相较于传统近红外一窗区域(NIR-I；750-900nm)更高灵敏度、更高分辨率、更大穿透深度的非侵入型活体成像，常用于活体精细结构的成像和测量，如血管阻塞判断、血流速度判断、脑肿瘤靶向及成像、活体器官体积测量等。

近红外二窗成像荧光基团很多，包括无机纳米材料和有机荧光染料。其中某些无机纳米材料潜在的生物毒性会导致生物体损伤，极大程度局限了NIR-II无机纳米材料在生物上的应用。有机染料种类较少，主要包括苯并双噻二唑(BBTD)，其为电子受体；三苯胺，其为电子给体的D-A-D类荧光分子探针；苯并[c,d]吲哚，其为配体的花菁类染料。目前为止报道的大多数荧光染料都表现出较弱的光稳定性和严重的光漂白现象，局限了此类染料在长时间循环追踪上的应用。少数与抗体偶联修饰得到的免疫探针多为物理性混合，导致其成分复杂，稳定性较差，不适用于临床。

因此，开发一种光稳定性较好的具有靶向性的近红外二窗荧光免疫探针具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于单域抗体与小分子荧光染料共价偶联的近红外二窗荧光免疫探针及其制备方法与应用。本发明荧光免疫探针可用于近红外二窗成像，荧光免疫探针与相应抗原结合后，其近红外二窗范围内荧光特异性增强，因而可应用于荧光活体成像技术中。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：