[发明专利]一种产气荚膜梭菌的分离方法

说明书

本发明提出了一种产气荚膜梭菌的分离方法，所述产气荚膜梭菌的分离方法包括以下步骤：(1)将病料部位进行增菌培养，得到产气荚膜梭菌菌液；(2)将步骤(1)得到的产气荚膜梭菌菌液稀释后，涂布于卵黄琼脂培养基，再覆盖上琼脂培养基后，进行培养基培养，得到产气荚膜梭菌落。本发明采取在下层TSC‑卵黄平板上加盖上层TSC覆盖的方式，会使细菌生长在严格厌氧的环境中，菌落相对独立，单菌落形态显而易见，细菌生长较好且很少出现各个菌落相连交错的现象，为后期挑取单菌落奠定了基础。

技术领域

本发明涉及菌种的提取分离技术领域，具体涉及一种产气荚膜梭菌的分离方法。

背景技术

产气荚膜梭菌又名魏氏梭菌，是广泛分布于自然界中的一种条件致病菌，也是动物肠道正常菌群的成员之一，它可以引产气荚膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犊、仔猪、家兔、雏鸡等的坏死性肠炎，对畜牧养殖业的影响很大。

目前，在进行实验室分离病原时，常用的方法有血琼脂平板法、TSC-卵黄平板法、CW平板法、SPS平板法等，由于产气荚膜梭菌是厌氧菌，且对培养基的要求很高，产气荚膜梭菌在上述4种方法的培养基上表现出不同的生长特性。

其中，在1％葡萄糖血平板上可观察到其特征性的溶血现象，但该培养基无选择性，不利于从污染的病料或肠内容物中分离产气荚膜梭菌。SPS平板可对某些厌氧菌或兼性厌氧菌有抑制作用而具有一定的选择性，这种培养基含铁和亚硫酸盐，产气荚膜梭菌可使亚硫酸盐还原成硫化物，产生黑色菌落，然而，少数产气荚膜梭菌不能在SPS平板上生长。CW平板的营养较为丰富，产气荚膜梭菌生长较茂盛，可对某些厌氧菌或兼性厌氧菌有抑制作用而具有一定的选择性，但是对梭状芽孢梭菌属的细菌和其他部分革兰氏阳性菌无抑制作用。

实验室分离产气荚膜梭菌最常用的就是TSC-卵黄平板法，大量试验研究表明，使用单层的TSC-卵黄平板法分离产气荚膜梭菌，可对某些厌氧菌或兼性厌氧菌有抑制作用而具有一定的选择性；TSC-卵黄培养基含铁和亚硫酸盐，产气荚膜梭菌可使亚硫酸盐还原成硫化物，后者与铁发生反应，形成一种黑色的硫化铁沉淀即黑色菌落；然而产气荚膜梭菌产生的卵磷脂酶水解卵黄卵磷脂,使黑色菌落的周围形成一个不透明的白晕，但容易在卵黄平板上蔓延生长，造成菌落融合，不易辨认。

因此，开发一种简便迅速最大限度地分离出产气荚膜梭菌的方法是本领域的研究重点。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种产气荚膜梭菌的分离方法。所述分离方法增加了双层分离技术，会使细菌生长在严格厌氧的环境中，菌落相对独立，单菌落形态显而易见，细菌生长较好且很少出现各个菌落相连交错的现象，为后期挑取单菌落奠定了基础。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种产气荚膜梭菌的分离方法，所述产气荚膜梭菌的分离方法包括以下步骤：

(1)将病料部位进行增菌培养，得到产气荚膜梭菌菌液；

(2)将步骤(1)得到的产气荚膜梭菌菌液稀释后，涂布于卵黄琼脂培养基，再覆盖上琼脂培养基后，进行培养基培养，得到产气荚膜梭菌落。

在本发明中，在卵黄琼脂培养基(即TSC-卵黄平板)上进行细菌涂布后再盖上一层TSC，即双层TSC法，就会使细菌生长在严格厌氧的环境中，此时菌落相对独立，单菌落形态显而易见，细菌生长较好且很少出现各个菌落相连交错的现象。

同时，由于细菌在单层卵黄琼脂培养基中生长时，菌落融合，不利于生长，分离率低，在空气中放置很短一段时间形成的亚硫酸盐的黑色菌落就会消失，不利于下一步的分离。而本发明加了再覆盖上琼脂培养基后(上层TSC)之后，菌落的蔓延受到了限制，菌落较独立，且在空气中放置很久形成的亚硫酸盐的黑色菌落也不会消失，方便下一步的细菌分离。