[发明专利]一种产气荚膜梭菌的分离方法

权利要求书

1.一种产气荚膜梭菌的分离方法，其特征在于，所述产气荚膜梭菌的分离方法包括以下步骤：

(1)将病料部位进行增菌培养，得到产气荚膜梭菌菌液；

(2)将步骤(1)得到的产气荚膜梭菌菌液稀释后，涂布于卵黄琼脂培养基，再覆盖上琼脂培养基后，进行培养基培养，得到产气荚膜梭菌落。

2.根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌的分离方法，其特征在于，步骤(1)中，所述病料部位包括盲肠、卵黄蒂前后、病变严重部位内容物、粪样中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述卵黄蒂前后为以卵黄蒂为中心前后各截取1～5cm的病料部位；

优选地，所述病料部位来自于坏死性肠炎病鸡和/或疑似病鸡。

3.根据权利要求1或2所述的产气荚膜梭菌的分离方法，其特征在于，步骤(1)中，所述增菌培养后得到的产气荚膜梭菌菌液的活菌数为4.5×10⁸-1.5×10⁹cfu/mL。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的产气荚膜梭菌的分离方法，其特征在于，步骤(1)中，所述增菌培养具体包括以下步骤：

(a)将病料部位置于缓冲溶液中，漩涡震荡后静置，得到上清液；

(b)将步骤(a)得到的上清液置于FT液体培养基中，进行厌氧培养，得到产气荚膜梭菌菌液。

5.根据权利要求4所述的产气荚膜梭菌的分离方法，其特征在于，步骤(a)中，所述病料部位和缓冲溶液的质量体积比为(1-10)g:(10-50)mL；

优选地，步骤(a)中，所述漩涡震荡的转速为800-1000rpm，所述漩涡震荡的时间为0.5-1min；

优选地，步骤(a)中，所述静置的时间为3-10min；

优选地，步骤(a)中，所述缓冲溶液为PBS溶液。

6.根据权利要求4或5所述的产气荚膜梭菌的分离方法，其特征在于，步骤(b)中，所述上清液和FT培养基的体积比为0.1:(4-6)；

优选地，步骤(b)中，所述FT液体培养基包括：FT、环丝氨酸和水；

优选地，步骤(b)中，所述FT液体培养基按重量份数计包括：10-20份的FT、0.5-2份的环丝氨酸液、400-600份的水；

优选地，所述环丝氨酸液为环丝氨酸的生理盐水溶液，其中环丝氨酸的浓度为30-50mg/mL；

优选地，步骤(b)中，所述厌氧培养的温度为38-42℃，所述厌氧培养的时间为16-24h。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的产气荚膜梭菌的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，每1mL稀释后得到的菌液中含10^-4-10^-2mL的未稀释产气荚膜梭菌菌液；

优选地，步骤(2)中，所述涂布的涂布量为5-10μL/cm²。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的产气荚膜梭菌的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，所述卵黄琼脂培养基包括：TSC、卵黄液、环丝氨酸和水；

优选地，步骤(2)中，所述卵黄琼脂培养基按重量份数计包括：10-20份的TSC、50-150份的卵黄液、0.5-2份的环丝氨酸液和300-500份的水；

优选地，所述环丝氨酸液为环丝氨酸的生理盐水溶液，其中环丝氨酸的浓度为30-50mg/mL；

优选地，所述卵黄液包括卵黄和FT液体培养基；

优选地，所述卵黄和所述FT液体培养基的体积比为(0.5-2):1。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的产气荚膜梭菌的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，所述琼脂培养基包括：TSC和水；

优选地，步骤(2)中，所述琼脂培养基按重量份数计包括：10-30份的TSC和400-600份的水。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的产气荚膜梭菌的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养基培养的温度为38-42℃，所述培养基培养的时间为16-24h。