[发明专利]一种用于单细胞测序的具有寡核苷酸序列的双层微球

说明书

本发明属于单细胞测序相关试剂，具体涉及一种双层结构的微球，外层材质为可在一定条件溶解的水凝胶(如含二硫键的聚丙烯酰胺)，内部为携带寡核苷酸序列的磁性微球。本发明以双层微球的内层小微球为寡核苷酸序列分子标签的基底，在内层磁性微球上利用化学键酶连接的方法将寡核苷酸按顺序连接到磁性微球上，合成为带有独特序列的微球，再将小微球包裹到大体积的外层微球内，制作成双层微球。本发明的微球继承传统硬质磁性微球的易于连接寡核苷酸序列的优点，同时有着外层软质微球更适用于单个液滴包裹单个微球，用于单细胞测序的优点，提高单细胞测序结果的稳定性和精确性，可以广泛的应用于医学、生物等研究。

技术领域

本发明属于单细胞测序试剂，具体涉及一种双层结构的具有寡核苷酸序列的微球。

背景技术

单细胞测序(single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq)是近几年兴起的新技术，它能够从单个细胞水平获得全转录组表达谱、扩增后进行高通量测序，从而高效地检测单个细胞内的基因表达水平，在肿瘤的诊断与治疗、靶向药物的设计、干细胞的发育与分化等领域具有重要的应用价值。

单细胞转录组测序之所以可以同时对成百数千个细胞进行测序，是因为每个细胞都贴有不同的标签，为了区别每个细胞中的每条mRNA，每条mRNA同样被赋予一个唯一的分子标签。目前单细胞测序的微流控平台，主要是将单个细胞与带有分子标签的单个微球置于一个微孔环境，细胞裂解后，不同的细胞可携带特异的细胞标签，经反转录同一个细胞的不同mRNA又被不同分子标签所标记。这种方法可追踪每个基因的细胞来源，而且可以对mRNA进行定量，显著提高了测序通量、降低测序成本并且减轻扩增偏好的影响。但是目前存在最新的基于液滴微流控技术的单细胞测序，可以将复杂的多个步骤集成与一个微流控芯片上，而传统的带有分子标签的微球均存在制作成本高、制备困难、制备成功率低、以及不同批次效果不稳定等诸多问题，最严重的是液滴微流控技术难以对传统微球形成单包裹，影响单细胞测序结果的稳定性和精确性，同时这也是的单细胞测序费用昂贵，不能广泛应用的原因之一。

发明内容

本发明针对上述问题，提供一种双层的具有寡核苷酸序列的微球，外层材质为可溶解水凝胶，内部为具有寡核苷酸序列的磁性微球，最终使得该微球继承传统硬质磁性微球的易于连接寡核苷酸序列的优点，同时外层大体积微球降低液滴单包裹微球的难度。

本发明公开了一种双层的具有寡核苷酸序列的微球，同时公开了一种制备双层的具有寡核苷酸序列的微球的方法。

本发明所述的具有寡核苷酸序列的双层微球，外层材质为可溶解的水凝胶，内部为具有寡核苷酸序列的磁性微球；

其中，所述寡核苷酸序列具有至少两个部分，C区和D区；C区为用于测序文库建立的通用DNA序列；D区序列长度在10bp-200bp，用于标识不同单细胞内的核酸，且包含一段用于和细胞内核酸结合的序列。

进一步地，D区序列的选择至少包含三部分,D1、D2和D3；其中D1的顺序为：【X】A，D2的顺序为CTG【Y】A，D3的顺序为CTG【Z】【polyT】；其中X，Y，或Z代表4-14bp长的任意DNA序列，polyT代表10-35个T。

进一步地，C区和D区的寡核苷酸序列通过化学键和DNA连接酶或聚合酶将三段按顺序依次连接到磁性微球上，利寡核苷酸序列结构特殊，有助于微球尺寸的控制。

进一步地，微球具有双层结构，外层材质为可溶性水凝胶，降低了液滴单包裹微球的难度；

进一步地，微球的外层材质可选择含二硫键的聚丙烯酰胺，含二硫键的聚丙烯酰胺微球质地软韧、微弹，且可溶解，比硬质材料在流道内更不容易堵塞；

进一步地，微球的直径尺寸30～300微米，容易占满流道，使得液滴能够在流道中整齐单列排布；