[发明专利]抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法

权利要求书

1.抑制雌激素受体阳性乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，建立检测乳腺癌干细胞增殖和迁移能力的体系；

所述步骤1的具体过程为：

步骤1.1，将人乳腺癌细胞系MCF-7使用RPMI-1640培养基，添加10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素，培养在37℃二氧化碳培养箱中，生长至对数生长期时用于实验；

步骤1.2，取步骤1.1所得的对数生长期的细胞胰酶分别进行消化、重悬后加入干细胞标志物ABCG2抗体，冰上避光孵育15min，清洗后离心弃去上清，定容后进行流式分选；

步骤1.3，将步骤1.2分选得到的乳腺癌干细胞铺板在吸附的96孔板中，以0～0.5μM浓度的嘌呤霉素处理24～72小时，待5～7天后镜下计数，测量直径，统计乳腺癌干细胞富集的乳腺微球的形成率；所述乳腺癌干细胞以500个细胞/孔铺板在吸附的96孔板中，以0.5μM浓度的嘌呤霉素处理48小时，待5天后镜下计数；

步骤2，基于步骤1建立的体系，针对雌激素受体阳性乳腺癌干细胞，采用不同浓度的嘌呤霉素，抑制癌干细胞的增殖和迁移能力；

所述步骤2的具体过程为：

步骤2.1，集落形成检测：将细胞接种在6孔板中，加药培养2周后弃去培养液，冰甲醇固定细胞后进行结晶紫染色，显微镜下计数集落；

步骤2.2，3D类器官直径测量：将乳腺微球接种至含有基底膜基质的离心管中混匀，铺板于超低吸附的12孔板中培养2天后加药处理，培养6天后测量形成的3D类器官直径；

步骤2.3，流式细胞术检测细胞周期：收集药物处理后的细胞，加入预冷70％乙醇4℃固定24小时，重悬后加入碘化丙啶染色液，室温避光后流式上样；

步骤2.4，划痕实验检测细胞迁移：将细胞接在6孔板中生长至约95％时，用枪头划痕，去除培养液后，加入药物后立即拍照，24小时后再次在相同位置拍照；

步骤2.5，western blot检测增殖相关蛋白表达：按照蛋白质提取试剂盒提取蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE进行电泳分离，转膜并封闭后加入一抗和二抗，ECL显色后扫描分析。