[发明专利]一种能够快速检测TMAO生物标志物的方法及试剂盒

说明书

本发明属于生物样本检测技术领域，具体涉及一种能够快速检测TMAO生物标志物的方法及试剂盒。该方法以液质联用为基础，涉及（1）设置液相色谱条件；（2）设置质谱条件；（3）配制标准样品；（4）建立标准曲线；（5）待测血浆预处理；（6）预处理血浆样品检测等主要步骤。为便于操作，本发明还进一步提供一种试剂盒及其使用方法。本发明提供的能够快速检测TMAO生物标志物的方法，通过对样品进行合理的预处理，并配合优化合理的液相色谱和质谱条件，获得准确性高稳定性好的检测结果；本发明还提供的试剂盒，提供浓度准确的内标和标准样品，以减少实际操作步骤，提高检测效率。

技术领域

本发明属于生物样本检测技术领域，具体涉及一种能够快速检测TMAO生物标志物的方法及试剂盒。

背景技术

氧化三甲胺（TMAO）在人体中参与了多项重要的生物学功能，普通人食用豆类、鸡蛋等含胆碱的食物后，在大肠内转化为三甲胺，三甲胺接着在肝脏的三甲胺氧化酶的作用下进一步转化为氧化三甲胺。近年来，有关TMAO的研究正受到越来越多的关注，有学者将TMAO浓度与多种慢性心脑血管疾病进行关联，将TMAO作为慢性心脑血管疾病的早期预警指标之一。此外，我们团队正致力于研究和构建TMAO与糖尿病并发症、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌等常见疾病的作用关系。因此，在实践中如何快速准确地检测样本中TMAO的浓度是开展一系列研究的基础。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种能够快速检测TMAO生物标志物的方法及试剂盒。

本发明提供的快速检测TMAO生物标志物的方法，包括以下步骤：

（S1）建立标准曲线：取空白血浆样品，加入甲醇后进行涡旋振荡，然后装入离心机进行离心处理，取上清液加水稀释；然后加入TMAO和内标，配制成一系列含内标浓度相同含TMAO浓度不同的标准样品；通过液相色谱-质谱联用对一系列标准样品进行测试，计算得到各标准样品对应的TMAO峰面积与内标峰面积的比值（Y）和各标准样品对应的TMAO浓度与内标浓度的比值（X），作出Y随X的变化曲线，即为标准曲线；

（S2）预处理样品检测：通过液相色谱-质谱联用对预处理血浆样品进行检测，计算得到TMAO峰面积与内标峰面积的比值，代入标准曲线，得到预处理样品中TMAO浓度与内标浓度的比值；根据预处理过程中的稀释倍数计算得到原始血浆样品中TMAO的浓度；

血浆样品预处理方法为：取血浆样品，加入含有内标的甲醇溶液后进行涡旋振荡，然后装入离心机进行离心处理，取一定量上清液加水稀释得预处理血浆样品。

进一步地，血浆样品预处理方法为：取血浆样品加入含有内标的甲醇溶液进行蛋白沉淀，离心处理使样品分层，再加水稀释。

更进一步地，血浆样品预处理方法为：取血浆样品35μL，加入100μL含有内标的甲醇溶液后进行涡旋振荡30-45s，然后装入离心机进行离心处理，离心机分离因数RCF为3600-8000，取50μL上清液加入200μL去离子水稀释得预处理血浆样品。

在上述血浆样品预处理过程中，内标的甲醇溶液为d9-TMAO浓度 30ng/mL的甲醇溶液（d9-TMAO是指氘代氧化三甲胺同位素标记物）。

进一步地，步骤（S1）中，取空白血浆样品350μL，加入1000μL甲醇后进行涡旋振荡30-45s，然后装入离心机进行离心处理，离心机分离因数RCF为3600-8000；取500μL上清液加入2000μL去离子水稀释，然后加入TMAO，用水逐步稀释得到10个含不同浓度的TMAO的溶液，TMAO浓度分别为：10、25、55、80、100、200、400、500、800、1000ng/mL；每个溶液各取300μL，各加入100μL含30ng/mL的d9-TMAO的甲醇溶液，得到一系列标准样品。

进一步地，液相色谱条件如下：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18液相色谱柱；

流动相：体积比为88:12的乙腈与0.1%甲酸水溶液；