[发明专利]一种贝莱斯芽孢杆菌及用途

权利要求书

1.一种贝莱斯芽孢杆菌，配方包括：贝莱斯芽孢杆菌；其特征在于：组分的质量百分比是：100％的贝莱斯芽孢杆菌。

2.一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：步骤一，取液稀释；步骤二，涂布培养；步骤三，形态鉴定；步骤四，分离纯化；步骤五，拮抗初筛；步骤六，拮抗复筛；步骤七，生理鉴定；步骤八，分子鉴定；步骤九，扩增培育；其特征在于：

其中上述步骤一中，取适量的酸菜汁，用倍比稀释法分别稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6，等量称取后得到多个稀释液；

其中上述步骤二中，用无菌玻璃涂布棒对步骤一中得到的多个稀释液分别进行等量蘸取，并均匀涂布到固体培养平板上，恒温培养，得到多个单菌落；

其中上述步骤三中，用接种环从步骤二中得到的单菌落里挑取适量的细菌，分别在固体培养平板上划线，恒温培养，观察菌落形状，并经革兰氏染色后在显微镜下观察，对菌落进行形态鉴定；

其中上述步骤四中，根据步骤三的鉴定结果，从步骤二中得到的多个单菌落里挑取出不同形态的，分别用划线平板法接种到固体培养平板上，纯化两次，得到纯化菌株；

其中上述步骤五中，以病原细菌为指示菌，接种到液体培养摇瓶中，恒温振荡培养，并使OD600为0.6～0.8，得到指示菌液，再按照1∶100的体积比量取对应量的指示菌液，倒在煮融后冷却至50℃的固体培养平板上混匀，用牛津杯点接上步骤四中得到的纯化菌株，凝固后恒温培养，测其抑菌圈直径，并以不点接纯化菌株为空白对照，筛选出对指示菌抑菌效果好的初筛拮抗菌；

其中上述步骤六中，挑取一环步骤五中得到的初筛拮抗菌，接种到液体培养摇瓶中，进行初次恒温振荡培养，并使OD600为0.6～0.8，得到拮抗菌液，再按照1∶100的体积比量取对应量的拮抗菌液，接种到液体培养摇瓶中，进行二次恒温振荡培养，接着转入离心机中，高速离心后取上清液，并经0.22μm孔径的滤膜过滤后放冰箱中4℃冷藏备用，得到抗菌发酵液，然后按照1∶100的体积比量取对应量的步骤五中得到的指示菌液，倒在煮融后冷却至50℃的固体培养平板上混匀，用牛津杯点接上备好的抗菌发酵液，凝固后恒温培养，测其抑菌圈直径，并以点接无菌水为空白对照，筛选出对指示菌抑菌效果好的复筛拮抗菌；

其中上述步骤七中，从步骤六中得到的复筛拮抗菌里挑取适量的细菌，分别用可溶性淀粉、甲基红、产氨、唯一碳源利用、唯一氮源利用、明胶液化、渗透压和柠檬酸盐共八项生理指标，对菌落进行生理生化鉴定；

其中上述步骤八中，从步骤六中得到的复筛拮抗菌里挑取适量的细菌接种到马铃薯液体培养基上，收集菌体并提取DNA，采用16SrDNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增，再对扩增产物进行测序，接着将得到的序列在NCBI网站上进行BLAST比对查找相似序列，选择相似性不小于99％的序列，再用MEGA软件N-J法构建系统发育树；

其中上述步骤九中，根据步骤七和步骤八的鉴定结果，从步骤六中得到的复筛拮抗菌里挑取出芽孢杆菌属的细菌，接种到固体培养平板上，恒温培养，得到贝莱斯芽孢杆菌。

3.根据权利要求2所述的一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，固体培养平板选用牛肉膏蛋白胨固体培养基和马铃薯固体培养基中的任意一种，牛肉膏蛋白胨固体培养基由重量比为3∶10∶5∶20∶1000的牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂和水混合制备而成，马铃薯固体培养基由量比为10∶1∶1∶50的马铃薯、葡萄糖、琼脂和水混合制备而成。

4.根据权利要求2所述的一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，恒温培养的温度为30℃，培养时间为2d。

5.根据权利要求2所述的一种贝莱斯芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：所述步骤五中，病原细菌选用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、齐整小核菌、链格孢菌、青枯雷尔氏菌、根癌农杆菌、胡萝卜软腐欧文式杆菌、橘青霉菌和霜霉菌中的任意一种。