[发明专利]一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法

说明书

一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法，包括将分离分选后的子宫内膜间充质干细胞接种到预先用纤连蛋白处理过的培养皿上，贴壁生长16～30小时；经PBS洗涤后，加入子宫肌层细胞来源的外泌体进行共培养，便可得到大量扩增的子宫内膜间充质干细胞。本发明提供的方法采用干细胞生态位子宫肌层细胞来源的外泌体富集Notch信号通路配体Jagged1，且具有良好的生物相容性及生物活性，能够最大限度的模拟干细胞在人体内的真实生长情况，与子宫内膜间充质干细胞体外共培养后有效促进干细胞增殖的同时能够维持其干性。因此，本发明提供的方法改良了干细胞体外培养，对提高子宫内膜间充质干细胞的临床应用具有重要意义。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法。

背景技术

近年来，研究表明人类子宫内膜中存在一定数量的间充质干细胞，子宫内膜间充质干细胞。这些干细胞具有自我更新，高度增殖和克隆形成能力，从而在月经周期后子宫内膜的再生中起重要作用，是治疗宫腔黏连和修复受损子宫内膜的理想的干细胞来源，也为临床上治疗阿舍曼综合症引起的不孕症患者提供了新的希望。因此，对子宫内膜间充质干细胞进行扩增培养对于目前相关疾病的治疗或者治疗方案的研究具有重要的意义。

目前的研究主要是通过CD140b和CD146的共表达或者单一的表面标记抗体SUSD2来分离鉴定子宫内膜间充质干细胞。但是干细胞一旦离开自身的生长环境，在体外培养过程中会很快分化失去干性，从而限制了其在临床上的应用。目前，大部分研究采用化学药物来维持干细胞体外培养的干性。但是化学药物由于是人工合成，对细胞存在一定的毒性，不能完美模拟干细胞在体内的正常生理状态，因此需要寻找一种能够有效维持干细胞体外培养的干性的生物方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种利用肌层细胞外泌体体外扩增子宫内膜间充质干细胞的方法，包括将分离分选后的子宫内膜间充质干细胞接种到预先用纤连蛋白处理过的培养皿上，贴壁生长16～30小时；经PBS洗涤后，加入子宫肌层细胞来源的外泌体进行共培养，便可得到大量扩增的子宫内膜间充质干细胞。

进一步地，上述子宫内膜间充质干细胞是通过磁珠分离得到的CD140b⁺

CD146⁺子宫内膜间充质干细胞。

进一步，上述共培养的时间为5～10天；优选为7天。

进一步地，子宫内膜间充质干细胞的分离方法包括如下步骤：

(1)将子宫内膜组织切成小块，用含有III型胶原酶和I型脱氧核糖核酸酶的PBS溶液进行重悬，消化后筛分；

(2)在重悬细胞液中加入Ficoll-Paque，通过离心法去除细胞悬液中红细胞、细胞碎片和细胞团块；

(3)将得到的上述细胞液与抗CD45抗体包被的磁珠进行培养来去除白细胞；

(4)利用抗上皮细胞标记CD368抗体的磁珠对内膜基质细胞进行阴性选择；将新鲜纯化的基质细胞接种到预先用纤连蛋白处理过的培养皿上，在37℃潮湿的CO₂培养箱中培养7-14天。

进一步地，用两次独立的磁珠分选方法对通过上述分离方法分离得到的子宫内膜间充质干细胞进行分离得到CD140b⁺CD146⁺子宫内膜间充质干细胞。

进一步地，上述两次独立的磁珠分选方法具体包括如下步骤：