[发明专利]适配体反蛋白石光子晶体传感材料和快速超灵敏无标记检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的方法

权利要求书

1.一种快速超灵敏无标记检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的方法，包括如下步骤：

(1)制备适配体反蛋白石光子晶体传感材料；包括如下步骤：

S1.制备聚甲基丙烯酸甲酯微球：在氮气气氛下，将除氧后的双蒸水、甲基丙烯酸甲酯和过硫酸钾混合，在搅拌条件下水浴加热反应，反应结束后以不同的转速离心，制备得PMMA微球；

S2.制备SiO₂反蛋白石光子晶体：将PMMA微球悬浮液与TEOS溶液混合，超声充分分散后蒸发干燥、煅烧，得到SiO₂反蛋白石光子晶体；

S3.制备适配体反蛋白石光子晶体传感材料

S3-1：氨基化修饰

将制备的SiO₂反蛋白石光子晶体振荡清洗，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液，密封后进行加热反应，得到修饰氨基后的反蛋白石光子晶体；

S3-2：胶体金在光子晶体表面的修饰

在修饰氨基后的反蛋白石光子晶体表面加入金纳米颗粒，室温下静置反应，反应完成后用双蒸水洗净并用氮气吹干，得到修饰胶体金后的反蛋白石光子晶体；

S3-3：将SEB适配体在金属浴中加热，用PBS缓冲液稀释，得到SEB适配体溶液；在修饰胶体金后的反蛋白石光子晶体表面滴加SEB适配体溶液，在恒温培养箱中孵育，得到所述适配体反蛋白石光子晶体传感材料，

SEB适配体序列为5'-HS-GGT ATT GAG GGT CGC ATC CAC TGG TCG TTG TTG TCT GTTGTC TGT TAT GTT GTT TCG TGA TGG CTC TAA CTC TCC TCT-3'(SEQ ID NO：1)；

步骤S2包括：配制0.08-0.12M盐酸8-12mL，称取0.8-1.2g盐酸放于试管中，依次添加0.8-1.2g正硅酸乙酯和1-2g无水乙醇于试管内，将试管放在摇床上在室温下震荡孵育0.8-1.2h，即可获得TEOS溶液；先将载玻片浸泡在水虎鱼溶液中16-30h，之后用双蒸水和无水乙醇分别清洗，放入立式展缸中用氮气吹干；取TEOS溶液加入到PMMA微球悬浮液中，超声10-30min充分分散后倒入展缸中，放入50-70℃真空干燥箱中静置蒸发干燥，结束后将光子晶体放于马弗炉中300-500℃煅烧，PMMA微球在高温下被除去，最终得到SiO₂反蛋白石光子晶体；

步骤S3-2包括：将10-15μL 70-90％的四羟甲基氯化磷和0.2-0.3μL1-3M的氢氧化钠加入40-50mL水中，剧烈搅拌4-6min，然后快速加入1-3mL 0.8-1.2％的氯金酸，溶液颜色变为深棕色，避光搅拌过夜，制备得金纳米颗粒；将修饰氨基后的反蛋白石光子晶体浸入一定体积的金纳米颗粒溶液中，然后在室温下静置4-10小时，反应完成后用双蒸水洗净并用氮气吹干；

(2)响应信号检测：将所述适配体反蛋白石光子晶体传感材料浸泡于双蒸水中，待检测系统稳定后用Maya 2000Pro光纤光谱仪在室温下测定初始反射峰值，然后加入待测样品，待稳定后观察并记录其对应反射峰强度，据此通过标准曲线计算待测样品中金黄色葡萄球菌肠毒素B的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括制备金黄色葡萄球菌肠毒素B标准曲线：根据步骤(1)-(2)由低到高依次测定一系列浓度的金黄色葡萄球菌肠毒素B标准溶液，以金黄色葡萄球菌肠毒素B标准溶液和其对应反射峰强度作图，得到标准曲线，确定金黄色葡萄球菌肠毒素检测范围及检出限。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S1包括：把除氧后的100-150mL双蒸水、20-30mL甲基丙烯酸甲酯和0.2-0.4g过硫酸钾，在氮气气氛下间隔依次加入三口烧瓶中，以200-400r/min的速度搅拌，70-90℃水浴反应30-60min，反应结束后以不同的转速离心，制备得PMMA微球，放于4℃冰箱保存。