[发明专利]一种表达病毒样颗粒的细胞核转化的转基因植物的制备方法及其在抵抗棉铃虫中的应用

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种表达病毒样颗粒的细胞核转化的转基因植物的制备方法及其在抵抗棉铃虫中的应用。本发明中构建烟草表达载体，成功检测到MS2噬菌体衣壳蛋白在烟草中高效表达，并检测hpRNA的表达，选取表达量最高的烟草株系。其次建立成熟的棉铃虫饲养体系，在此基础上进行棉铃虫生理测试。本发明的技术方案有效地提高的植物对棉铃虫的抗性，抑制了棉铃虫的生长以及化蛹，目的基因Ace1在处理组显著性下调，说明病毒样颗粒介导的RNAi的成功应用可以有效提高植物对棉铃虫的抗性。通过VLP介导的RNAi分子递送技术在植物中的成功应用为棉铃虫的防治奠定了坚实的基础，为棉铃虫的防控提供了一种有效的途径。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种表达病毒样颗粒的细胞核转化的转基因植物的制备方法及其在抵抗棉铃虫中的应用。

背景技术

棉铃虫是我国最重要的农业害虫之一，也是世界性害虫，危害的植物多达200余种，使用苏云金芽孢杆菌(Bt)来防治棉铃虫被认为是一种环境友好的防治方法，得到了广泛的应用。但是随着其广泛种植也带来了新的问题，例如棉铃虫对Bt出现抗性、次要害虫变成主要害虫、棉铃虫的进化加速等等。近些年发展起来的RNAi的抗虫技术有着序列专一性高，环境友好的优点，为害虫的治理提供了新的思路和方向。

RNAi是一种在真核生物中由dsRNA诱发的基因沉默现象，由核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成21-24nt的siRNA，接着siRNA与体内的一些AGO蛋白酶形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，进而对互补的mRNA进行切割，导致mRNA的降解，诱发基因的沉默。在害虫防治领域，RNAi技术通过抑制害虫关键基因的表达，从而影响害虫生长或者杀死害虫。该技术具有序列特异性，针对特定的靶位点，对作物和人畜无害，具有较大的应用潜力。

过去10来年中，利用植物介导的RNAi技术在害虫防治方面取得了令人瞩目的成就。最早的报道：Mao等用表达P450基因RNAi分子的烟草和棉花饲喂棉铃虫后，棉铃虫肠道中P450基因的表达显著降低，从而抑制了棉铃虫的取食和生长发育。进一步研究表明同时在棉花中另外转入半胱氨酸蛋白酶基因能够进一步提高RNAi的抗虫效果；Baum等对玉米进行基因改造，使其表达以玉米根萤叶甲(Diabroticavirgifera virgifera Leconte)的液泡ATP酶的A亚基基因为靶标的RNAi分子，结果表明，取食经过基因改良的玉米能够抑制害虫肠道细胞靶标基因的表达，经过基因改良的玉米根部遭受的破坏要比野生型玉米的少50％；通过植物介导的RNAi抗棉铃虫的研究中，不同课题组也报道了针对不同的靶标基因，可以抑制相应基因的表达，转基因植物对棉铃虫具有一定程度的抗性；另外，Ni等报道了通过在棉花中聚合RNAi与Bt能够进一步提高植物的抗虫性并延缓棉铃虫对Bt抗性的进化速度。通过植物介导的RNAi对刺吸式口器害虫也有成功的报道，如Pitino等用含有唾液腺MpC002基因和肠道Rack1基因表达的dsRNA的转基因植物喂食桃蚜，发现60％以上桃蚜的目标基因表达受抑制，同时其后代数量明显减少。Zha等证明了RNA干扰抗虫同样能够用在抗刺吸式昆虫---水稻褐飞虱上，取食表达RNAi分子的水稻能够抑制对应基因的表达；王晖等用细胞色素P450基因表达的dsRNA喂食麦长管蚜与桃蚜，成功抑制了蚜虫体内的细胞色素表达，最终导致蚜虫死亡。

尽管植物核转基因介导的RNAi技术在虫害治理方面取得了令人瞩目的成就，但是其抗虫效果相对于利用Bt作物抗虫不太理想。其可能的原因在于：①由于昆虫缺少RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)，RNAi抗虫效果将取决于吸收dsRNA剂量，然而通过细胞核转化表达的dsRNA量不够高，不足以引起目标害虫显著的RNAi反应。②由于植物自身具有RNAi途径，植物中表达的dsRNA会被植物本身的Dicer加工成siRNA，而植物产生的siRNA对抗虫的效果不佳。因而整体上降低了抗虫效果。因此，提高杀虫dsRNA在植物的表达水平，并提高其在植物中的稳定性，将是有效提高抗虫效果的一种策略。

综上所述，现有技术存在的问题是：