[发明专利]一种新型高效微量检材核酸提取试剂、试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种新型高效微量检材核酸提取试剂，包括裂解液，其特征在于，所述裂解液包括有双功能螯合剂，所述双功能螯合剂同时具有金属螯合端和蛋白锚定端，所述双功能螯合剂为NOTA、MAA-NOTA、p-SCN-Bn-NOTA、p-SCN-NODA、MAA-GA-NODA、MAA-DOTA、DOTA-NHS、iEDTA或p-SCN-Bn-DTPA；其中，

所述NOTA为1,4,7-三氮环壬烷-1,4,7-三乙酸；

所述MAA-NOTA为(2,2'-(7-(2-((2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸；

所述p-SCN-Bn-NOTA为2-(4-异硫氰苯基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸；

所述p-SCN-NODA为1,4,7-三氮杂环辛烷-1,4-二乙酸-7-对异硫氰基苄基；

所述MAA-GA-NODA为2,2'-(7-(1-羧基-4-((2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧丁基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸；

所述MAA-DOTA为2,2',2″-(10-(1-羧基-4-((2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧丁基)-1,4,7,10-三氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸]；

所述DOTA-NHS为2,2',2”-(10-(2-((2,5-二氧吡咯烷-1-基)氧)-2-氧乙基)-1,4,7,10-三氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸；

所述iEDTA为1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸；

所述p-SCN-Bn-DTPA为2-(4-异硫代氰酰基苄基)-二乙烯三胺五乙酸。

2.根据权利要求1所述的一种新型高效微量检材核酸提取试剂，其特征在于，所述裂解液中所述双功能螯合剂的浓度为1-20mmol/L。

3.根据权利要求1所述的一种新型高效微量检材核酸提取试剂，其特征在于，所述裂解液包括3-7mol/L的胍盐、5-10mmol/L的所述双功能螯合剂、0.1-0.4mol/L的非离子表面活性剂、10-100mmol/L的pH缓冲剂和1-4mol/L的异丙醇溶液。

4.根据权利要求3所述的一种新型高效微量检材核酸提取试剂，其特征在于，所述胍盐为盐酸胍、异硫氰酸胍、硝酸胍、磷酸胍或碳酸胍。

5.根据权利要求3所述的一种新型高效微量检材核酸提取试剂，其特征在于，所述非离子表面活性剂为乙基苯基聚乙二醇、聚乙二醇辛基苯基醚或失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚。

6.一种新型高效微量检材核酸提取试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-5之一所述的裂解液。

7.根据权利要求6所述的一种新型高效微量检材核酸提取试剂盒，其特征在于，还包括纳米磁珠、结合液、第一洗涤液、第二洗涤液、Bind酶和洗脱液。

8.根据权利要求7所述的一种新型高效微量检材核酸提取试剂盒，其特征在于，所述结合液中包括有2-5mol/L的硫氰酸胍。

9.根据权利要求7所述的一种新型高效微量检材核酸提取试剂盒，其特征在于，所述结合液包括3-4mol/L的硫氰酸胍、50-150mmol/L的pH缓冲剂；

所述第一洗涤液包括等体积比的所述裂解液和乙醇混合液、终浓度1-5wt.％的聚乙烯吡咯烷酮、终浓度50-150mmol/L的pH缓冲剂；

所述第二洗涤液包括体积分数70％的乙醇溶液；

所述洗脱液为纯水或TE缓冲液。

10.根据权利要求9所述的一种新型高效微量检材核酸提取试剂盒的使用方法，其特征在于，所述试剂盒包括纳米磁珠1.2ml、裂解液30ml、结合液30ml、第一洗涤液30ml、第二洗涤液30ml、Bind酶110μg、洗脱液5ml；

使用方法包括以下步骤：

S1、将110μl洗脱液加入到110μg Bind酶中，涡旋混匀，室温放置10min后使用；洗涤液加入80ml无水乙醇进行稀释备用；

S2、按每例样品320μl裂解液和2μl的Bind酶配制为混合液，当检材为骨骼、牙齿或精斑时，单个样品再加入10μl二硫苏糖醇；

S3、检材中加入330μl所述混合液，涡旋混匀，与95℃裂解30min；

S4、13000×g离心2min收集消化液，加入300μl的结合液和20μl的纳米磁珠，混匀l0-15次，室温静置5min，期间每30s混匀一次，每次6s；

S5、转移至磁力架上吸附5min后，吸弃液体；

S6、加入300μl第一洗涤液，涡旋10s重悬磁珠，转移至磁力架上吸附2min，吸弃液体；

S7、加入500μl第二洗涤液，涡旋10s重悬磁珠，转移至磁力架上吸附2min，吸弃液体；

S8、重复步骤S7一次或两次；

S9、离心收集管壁上的液滴，转移至磁力架上吸附1min，吸弃所有溶液，空气干燥10min；

S10、加入30-50μl洗脱液，涡旋打散磁珠，于55℃振荡温育10min；

S11、转移至磁力架上吸附3min，把液体转移至新的离心管中，得到核酸提取液。