[发明专利]抑制J亚群禽白血病病毒复制的组合物及其应用

说明书

本发明公开了一种抑制J亚群禽白血病病毒复制的组合物及其应用，属于兽用生物制品技术领域。所述抑制J亚群禽白血病病毒复制的组合物包括：shRNA表达质粒和AZT；所述shRNA表达质粒是由shRNA序列连接入质粒载体中构建而成。应用shRNA表达载体及逆转录酶抑制剂AZT在清除细胞内的ALV的作用上具有协同效果，两者联合应用能够显著降低DF‑1细胞内禽白血病病毒的病毒量以及p27抗原水平，能够显著抑制ALV复制，在细胞水平上具有较好的抗禽白血病病毒效果。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种抑制J亚群禽白血病病毒复制的组合物及其应用。

背景技术

禽白血病(Avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avianleukosis virus，ALV)引起的、禽类多种肿瘤性疾病的统称，主要表现为鸡的良性、恶性肿瘤和亚临床感染，导致鸡只生长迟缓、产蛋下降和免疫抑制。自AL被发现以来，该病呈现出世界性流行趋势，近年来在中国鸡群中广泛传播，对鸡群的安全构成了严重威胁，给我国养殖业的发展带来了巨大困扰，并给地方品种鸡保种和选育工作带来很大的困难。禽白血病病毒属于反转录病毒科、正反录病毒亚科、甲型反转录病毒属。该科病毒的基因组为RNA，以具有反转录酶为特征。目前，根据gp85基因的特性，将ALV分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K共11个亚群。目前，ALV-J在很多种类鸡群中均发现感染且病毒呈现出极大的基因多样性。鉴于该病的重大危害，《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》将AL列为我国需要优先净化的禽病。ALV主要通过种蛋垂直传播，另外，使用了被ALV污染的弱毒疫苗也是该病传播的一个重要方式。目前，尚无针对禽白血病的商品化疫苗与特效药物，主要通过对现有种鸡群净化来控制该病。

齐多夫定(Zidovudine，AZT)是一种核苷类逆转录酶抑制剂具有抗逆转录酶的活性，能够在组织培养中抑制HIV复制，临床试验证明它能延缓艾滋病程，推迟机会性感染。先前，已有研究证明了药物能够在一定程度上抑制J亚群禽白血病病毒的复制。由于AZT与脱氧胸腺嘧啶核苷酸(T)很相似，逆转录酶也错将其利用，但因其脱氧核糖的第3位缺少羟基，不能与另一核糖核苷酸上的第5’端的羟基与磷酸酯化相连，因此不能够形成3,5-磷酸二酯键，DNA链的编码被中断了，因此阻碍了逆转录病毒的复制。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是通过内源性或外源性双链RNA(doublestrand RNA，dsRNA)的介导，特异性降解相应序列的mRNA，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能型缺失，属于转录后水平的基因沉默(post-transcript gene silencing，PTGS)现象。作为古老的、进化保守的基因沉默机制，RNAi对细胞防御病毒的感染、修复遗传损伤及调节正常的基因功能具有重要作用。现在，RNAi作为一种简单有效的分子生物学工具，研究人员通常采用化学合成，或质粒载体、病毒载体表达所需要的dsRNA，进而诱导特异有效的RNAi进行基因功能研究和疾病治疗。前期研究表明，通过设计针对不同靶位点的siRNA(如有研究针对gag基因、env基因或LTR区域)，可以有效干扰ALV-J的复制。

但是，AZT虽然可以在细胞水平上抑制ALV-J的复制，具有一定的效果，但高剂量AZT会对细胞造成损伤；而且，高剂量AZT的长期使用可能会导致耐药毒株的出现。RNAi是一种强有效的抑制基因功能的工具，但RNAi技术的难点在于如何选择靶标区域设计shRNA表达质粒，针对ALV-J病毒基因组不同靶基因的RNAi在抑制禽白血病病毒复制的效果各不相同；而且，RNAi技术一般是单独使用，目前还很少见有基于RNAi技术设计的shRNA表达质粒与其他药物联合应用治疗J亚群禽白血病的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种抑制J亚群禽白血病病毒复制的组合物及其应用。本发明发现，应用shRNA表达载体及逆转录酶抑制剂AZT在清除细胞内的ALV的作用上具有协同效果，两者联合应用能够显著降低DF-1细胞内禽白血病病毒的病毒量以及p27抗原水平，能够显著抑制ALV复制，在细胞水平上具有较好的抗禽白血病病毒效果。