[发明专利]一种人脐带间充质干细胞制剂及其应用

权利要求书

1.一种用于促进皮肤创面愈合的hUC-MSCs细胞制剂，其特征在于，包含hUC-MSCs细胞和纤维蛋白凝胶；其中，所述纤维蛋白凝胶用作hUC-MSCs细胞移植时的支架。

2.根据种权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于，每1×10⁶个hUC-MSCs细胞用5～20μl浓度为5～30mg/ml的纤维蛋白原溶液重悬。

3.一种权利要求1～2任意一项所述的细胞制剂在制备哺乳动物皮肤创面愈合药物中的应用，优选地，在制备治疗糖尿病皮肤慢性溃疡药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括：用纤维蛋白原溶液重悬hUC-MSCs细胞，然后将其均匀滴加至创面，随后在创面处均匀滴加等体积的凝血酶溶液，待成胶后粘上敷贴用以维持细胞存活所需的湿润无菌环境。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纤维蛋白原溶液的浓度为5～30mg/ml，所述凝血酶溶液浓度为20～50U/ml。

6.一种带有绿色荧光标记的人脐带间充质干细胞(EGFP-hUC-MSCs细胞)，其特征在于，由人脐带间充质干细胞用EGFP标记得到；其中，所述EGFP为增强绿色荧光蛋白。

7.根据权利要求6所述的EGFP-hUC-MSCs细胞，其特征在于，通过以下方法制备得到：

S1：从脐带中分离人脐带间充质干细胞进行消化传代；

S2：将人脐带间充质干细胞进行扩增培养及鉴定；

S3：构建EGFP标记的hUC-MSCs细胞，即得EGFP-hUC-MSCs细胞。

8.根据权利要求7所述的EGFP-hUC-MSCs细胞，其特征在于，S1包括以下步骤：

S1-1：将脐带中的血液用生理盐水冲洗干净，剪成小段，完全浸泡于“PBS+双抗”保存液中；

S1-2：用含1％双抗的PBS溶液冲洗脐带表面；

S1-3：分离脐动脉、脐静脉以及脐带表面的外膜，将脐带切成小段，于培养箱中培养，细胞长至80％-90％融合率时，开始消化传代；

S2包括以下步骤：

S2-1：将S1消化传代得到的细胞群体在含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养；

S2-2：细胞长至80％～85％融合率时，取出两份分别更换成脂诱导培养基和骨诱导培养基培养，并分别进行油红O染色分析和茜素红S染色分析；

S2-3：离心收集细胞，流式检测CD34、CD45、CD90和CD105指标；

S3包括以下步骤：

S3-1：取指数生长期的293T细胞传至大皿中，细胞数在70％-80％，37℃、5％CO₂培养箱培养过夜；

S3-2：取2个EP管，在一号管中将Lipo 2000加入OptiMEM中混匀后静置，在二号管中将Plvx-EGFP、VSV-G、PMDL、RSV慢病毒质粒加入OptiMEM中混匀后静置，将一号管中液体滴加至二号管，混匀后室温静置；

S3-3：将步骤S3-2静置后的液体滴加至预热的DMEM+10％FBS培养基中，混匀，弃去细胞旧液，将混合物沿壁滴加至大皿中，补充新鲜完全培养基进行培养，然后收集病毒液并离心收集上清液；

S3-4：将LentiX浓缩液与S3-3收集的上清液混合，放置过夜后离心弃上清，留灰白色沉淀；

S3-5：使用冷PBS重悬灰白色沉淀，直接感染人脐带间充质干细胞，获得EGFP-hUC-MSCs细胞。