[发明专利]一种稻瘟病菌的分离方法

说明书

本发明公开了一种稻瘟病菌的分离方法。该方法采用一种专用的孢子滑散丝，直接从稻瘟病标样中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的稻瘟病菌菌株。分离培养的实施操作步骤如下：1)稻瘟病标样的采集；2)稻瘟病菌标样的处置；3)孢子滑散丝的制备；4)孢子滑散板的制备；5)分生孢子的分散；6)切割载孢滑散板；7)分生孢子的培养与单孢子菌株的形成。本发明具有如下优点：1)分离孢子用的关键器具简单易制，分离操作简单易行；2)分离与取得单孢菌株能一次到位；3)分离工作耗工少耗时短；4)能显著提高稻瘟病菌分离的工作效率及分离结果的可靠性。

技术领域

本发明涉及植物病理学技术。具体是一种稻瘟病菌的分离方法。

背景技术

稻瘟病是我国水稻生产的一种重大病害，该病害由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)侵染引起。开展稻瘟病菌的生物学研究是稻瘟病防控的重要基础。而开展稻瘟病菌生物学研究的前提，必需要拥有稻瘟病菌材料。一般实验室往往需要从病害标样中分离获得稻瘟病菌。

稻瘟病菌群体的遗传组成复杂，不同菌株的生物学特性及致病性往往存在较大差异。正常的研究通常需要取得遗传组成单一的稻瘟病菌材料，或者说单克隆菌株材料。本领域一般认为由单一孢子生长形成的菌株材料属遗传组成单一的病菌材料。因此稻瘟病菌的分离菌株材料一般需要获得单孢分离菌株材料。

至今已有公开多种稻瘟病菌的分离方法，主要是组织分离培养方法和分生孢子分离培养方法。

组织分离培养方法的主要技术特征是，需要将带菌组织进行表面消毒，再将消毒后的组织块转移到培养基上培养。该方法容易被腐生杂菌污染，重要的是分离获得的纯培养菌一般不属于遗传组成单一的稻瘟病菌。

分生孢子分离方法，包括悬浮液法、震落法、和直接挑取法等。

悬浮液法先将待分离标样进行保湿产孢，然后通过水介质洗涤产孢标样，将分生孢子洗涤到水液中形成孢子悬浮液，再通过微量移液枪或毛细管等器具，将孢子悬浮液分解成微滴的手段，将孢子分散和分开，然后选择分解成单个分生孢子的微滴，再进行培养。这类方法必需要实施孢子液的孢子定量及稀释操作过程，比较费事，而且很容易出现杂菌污染而影响分离工作的效率与效果。

震落法通过将已经保湿产孢的标样置于培养平板上方进行敲震处理，把分生孢子震落在培养平板上，再从中选择分散的单孢子进行培养。这类方法仍然受到标样上的杂菌孢子的干扰；而且搜寻目标单孢子存在较大的盲目性；当找到单孢子后，转移单孢子的操作也较为费事。

直接挑取法，多需要在普通显微镜上增加额外的辅助技术装置。没有辅助技术装置的直接挑取，操作难度较大，一般需要操作者具备较好的显微操作技巧。

发明内容

本发明的目的是，提供一种分离培养获得遗传组成单一的稻瘟病菌纯培养的分离方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种稻瘟病菌的分离方法，采用一种专用的孢子滑散丝，直接从稻瘟病标样中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的稻瘟病菌菌株，分离培养的操作步骤如下：

1.稻瘟病标样的采集：在稻瘟病发病期间到田间采集稻瘟病标样，采摘干净新鲜的病斑标样带回实验室，凉干后置于4℃冷藏箱存放。

2.稻瘟病标样的处置：将步骤1存放的稻瘟病标样进行常规表面消毒与清洁，并进行常规保湿培养，直至标样病斑表面形成分生孢子。

3.孢子滑散丝的制备：取无墨水的一次性水笔笔芯在火焰上灼烧，笔芯燃火处熔化，安全熄火后，用尖头镊子夹住一点熔化的笔芯，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，形成一支分离稻瘟病菌分生孢子使用的孢子滑散丝，该滑散丝包括滑动丝a、丝杆b部分。

4.孢子滑散板的制备：