[发明专利]一种稻瘟病菌的分离方法

权利要求书

1.一种稻瘟病菌（ Magnaporthe Oryzae ） 的分离方法，其特征是，采用一种专用的孢子滑散丝，直接从稻瘟病标样中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的稻瘟病菌菌株，分离培养的操作步骤如下：

1)稻瘟病标样的采集：在稻瘟病发病期间到田间采集稻瘟病标样，采摘干净新鲜的病斑标样带回实验室，凉干后置于4℃冷藏箱存放；

2)稻瘟病标样的处置：将步骤1)存放的稻瘟病标样进行常规表面消毒与清洁，并进行常规保湿培养，直至标样病斑表面形成分生孢子；

3)孢子滑散丝的制备：取无墨水的一次性水笔笔芯在火焰上灼烧，笔芯燃火处熔化，安全熄火后，用尖头镊子夹住一点熔化的笔芯，轻轻拉长，至形成一根发丝状的细丝，冷却后剪去多余的细丝，形成一支分离稻瘟病菌分生孢子使用的孢子滑散丝，该滑散丝包括滑动丝(a)、丝杆(b)部分；

4)孢子滑散板的制备：

①琼脂平板基质的制备：按照琼脂15g、水1000ml的配比，配制含有常规营养的琼脂基质，常规高温高压灭菌后，成为琼脂平板基质备用；

②琼脂平板的倒制与平板表层净化：将操作①制备的琼脂平板基质加热充分熔化，趁热倒入培养皿制成薄层平板，并将该热液状的平板置于能继续保持热液状的保温装置内，保温静置20分钟以上，然后将该静置的液状薄层平板，平稳转移到无菌工作台面，待液状薄层平板冷凝后，成为表层净化的琼脂平板；

③孢子滑散板的切制与装片：用灭菌刀片将操作②制成的琼脂平板，切割成长条状的琼脂条块，该琼脂条块就是起分散孢子作用的滑散板；用灭菌刀片将该滑散板挑起装放到灭菌载玻片上，成为备待分散孢子用的滑散板(c)；

5)分生孢子的分散：将步骤3)制备的孢子滑散丝进行常规表面消毒和清洁，然后手执孢子滑散丝的丝杆(b)，将滑动丝(a)的端部，在步骤2)处置的标样病斑表面轻轻点触而粘附分生孢子，将粘有孢子的滑动丝(a)转移到步骤4)准备的孢子滑散板(c)的一端，并贴放于滑散板面上，沿着滑散板面滑移滑动丝(a)，滑动丝(a)在滑散板面的相对滑动，导致滑动丝(a)上粘附的孢子脱开散落在滑散板面上；

6)切割载孢滑散板：将步骤5)得到的载有分生孢子的滑散板(c)，置于显微镜下观察，沿着滑动丝(a)的滑动轨迹寻找离散的孢子，找出单一出现的孢子，选择与左右相邻孢子间隔距离远的单一孢子，用灭菌刀片将该单一孢子左右的滑散板(c)切断及移开，得到只载有唯一1个分生孢子的小方块；

7)分生孢子的培养与单孢子菌株的形成：用刀片将步骤6)切出的载有单一分生孢子的小方块，转移到稻瘟病菌的常规培养基上，常规培养，直到孢子萌发生长形成单孢子菌落；移植单孢子菌落的菌丝扩大繁殖，形成稻瘟病菌单孢子分离菌株。