[发明专利]一种孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法

说明书

本发明提供了一种孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法。本发明第一方面提供了一种孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，包括如下步骤：将氧化石墨烯、丙烯酸、二氯亚砜、对苯二酚和三乙胺混合，并在保护气体氛围下合成丙烯酸功能化石墨烯；将丙烯酸功能化石墨烯溶于二甲基甲酰胺中，得到功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液；将功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液、丙烯酰胺、N‑异丙基丙烯酰胺水溶液、Tris‑HCl、SDS、TritonX‑100、光敏化合物MAP‑mPyTC以及APS和TEMED混合得到复合型聚丙烯酰胺凝胶。根据本发明提供的制备方法制备得到的复合型聚丙烯酰胺凝胶，可根据温度调控其尺寸，并且凝胶尺寸调控可逆，所需变化时间短。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶及其制备方法。

背景技术

蛋白质印迹法(Western Blot)是细胞与分子生物学和免疫遗传学中常用的一种蛋白测定方法。具体流程是通过使用凝胶电泳分离样品中的蛋白质，随后将蛋白质转移到膜(例如：硝酸纤维素或PVDF膜)，接着用对靶蛋白质具有特异性的抗体来检测样品中的蛋白质。由于蛋白是经过电泳分离后再进行抗体结合反应，故较少受到抗体交叉反应性的影响。因此，即使在复杂的样品如细胞裂解物中，也能够清楚地区分靶上和靶外信号。然而，传统的蛋白印迹方法中所测定的结果是基于大量细胞样品的蛋白平均表达水平，其结果掩盖了单个细胞蛋白的表达量的特殊性和多样性。UC伯克利大学的Amy Herr教授提出一种单细胞的蛋白质印迹术(Single-cell western blot)，采用基于N-(3-((4-benzoylphenyl)formamido)propyl)methacrylamide(BPMAC)光敏型凝胶原位固定电泳分离后的蛋白进行免疫印迹，在一块微芯片上实现数千个单细胞蛋白质表达水平的测定和细胞异质性的研究。单细胞蛋白质免疫印迹实验的基本流程包括：(1)单细胞捕获和裂解：细胞在分选后，经重力作用沉降进入单细胞捕获单元；(2)凝胶电泳：加入预热至55℃的类RIPA的裂解电泳缓冲液裂解15秒。细胞在裂解后，在芯片两端施加电场，蛋白在电场的作用下进入芯片表面的凝胶涂层中，并开始电泳分离；(3)蛋白固定：凝胶电泳结束后，通过对凝胶表面进行一定波长和强度的紫外光激发照射，使凝胶涂层蛋白条带中蛋白分子和凝胶单体分子原位聚合；(4)免疫印迹蛋白分析：将固定好的蛋白分子用特异性的一抗结合，洗脱，再用带有荧光或发光基团标记的二抗结合，洗脱。最后在激光共聚焦荧光显微镜下，测定目标蛋白分子的荧光信号强度。

传统的聚丙烯酰胺凝胶在电泳时充当分子筛基质，使得蛋白质分离；抗原抗体反应时，凝胶固定住蛋白质充当免疫印迹的支架。然而传统的凝胶支持介质性能单一，凝胶孔径固定，往往只能分离分子量在30-250kDa的蛋白质，极大地限制了单细胞蛋白质免疫印迹技术的应用。当凝胶孔径过大时，小分子量蛋白质的分离分辨率较低，蛋白质固定效率减低，极大的影响了检测结果的准确性；大分子量蛋白在抗体孵育过程，抗体由于分子量过大难以进入凝胶基质结构与凝胶内固定住的蛋白质分子反应结合，极大的影响了检测结果的灵敏度与线性范围。

因此，设计研究合成方法简单、对小分子量蛋白质分离分辨率高，同时在抗体孵育环节可使凝胶孔径变大，使得抗体易于进入凝胶介质内的聚丙烯酰胺凝胶对单细胞蛋白质免疫印迹技术的生物学应用具有重要的理论和现实意义。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种对小分子量蛋白质分离分辨率高，孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶。

为实现上述目的，本发明提供了一种孔径可控的复合型聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、将氧化石墨烯、丙烯酸、二氯亚砜、对苯二酚和三乙胺混合，并在保护气体氛围下合成得到丙烯酸功能化石墨烯；

步骤2、将所述丙烯酸功能化石墨烯溶于二甲基甲酰胺中，得到功能化石墨烯的二甲基甲酰胺溶液；